2018, Vol. 38 
药物的体内过程导致药物的药理活性发生变化，直接引起药物活性变化和安全性的风险，药物代谢在新药的设计与开发，药物临床前评价与研究，治疗药物检测以及药物安全性评价等方面都具有重要意义。但是在实际的临床前评价中并不能直接在人体进行实验，而是通过动物的体内与体外等途径获取申报所需的药效学，药代学以及毒代方面的资料，以判断药物成药的可能性以及在人体应用的安全范围。药物体外代谢研究对药效评价与安全性评价具有非常重要的意义。
斑蝥素有剧毒，对泌尿系统和消化系统有严重刺激性，因此，近年来人们陆续合成了毒副作用小的斑蝥素衍生物[1-3]。甲基斑蝥胺（N-methylcantharidimide）为斑蝥素衍生物，化学名称为N-甲基-六氢-3a，7a-二甲基-4，7-环氧异苯骈吡咯-1，3-二酮，分子式为C11H15NO3，相对分子质量209.24。甲基斑蝥胺作为斑蝥素衍生物保留了斑蝥素的抗肿瘤作用，但减轻了其毒副作用，为临床抗肿瘤治疗提供了安全可靠的药物[4]。
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图 1 斑蝥素及甲基斑蝥胺分子结构 Figure 1 The molecular structure of cantharidin and N-methylcantharidimide |
甲基斑蝥胺体内过程复杂，其在生物转化过程中的代谢产物及代谢中间体的研究，对甲基斑蝥胺的药效和毒性作用关系的阐明极为关键，但是目前对于甲基斑蝥胺的体内过程研究极其有限，而基于体内生物转化过程的甲基斑蝥胺代谢研究未见报道[5-7]。本研究拟采用在中药复杂成分研究以及在环境分析、中药代谢、药物分析等领域运用广泛的超高效液相色谱与高分辨质谱（high resolution mass spectrometry，HRMS）联用技术[8-14]，对甲基斑蝥胺在小鼠体内的体内药物代谢过程进行分析，为甲基斑蝥胺在新药发现方面研究提供重要参考。
1 仪器与试药Triple TOF 4600高分辨质谱系统（SCIEX公司）；LC-30AD超高效液相色谱系统（SHIMADZU公司），R21G型高速冷冻离心机（日立公司）；Elix10超纯水净化系统（MILLIPOER公司）；XS-105十万分之一精密电子天平（METTLER TOLEDO公司）。MetabolitePilot代谢物分析鉴定软件（版本1.2.1，SCIEX公司）。Kinetex XB-C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Phenomenex公司）
甲基斑蝥胺片和甲基斑蝥胺对照品（由重庆市中药研究院制药厂提供，批号22100201），甲酸（formic acid，Sigma-Aldrich公司，批号56302-10 ML）乙腈、甲醇均为色谱纯（Fisher公司），水为超纯水。
2 方法 2.1 溶液制备甲基斑蝥胺片25片磨碎，混悬于0.5 %羧甲基纤维素钠溶液中，并转移定容至5 mL量瓶中，制成50 mg·mL-1溶液，临用时用0.5%羧甲基纤维素钠溶液稀释。
精密称取甲基斑蝥胺对照品10.2 mg于10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，以甲醇分别稀释至10.2、51、102、510、1020、5 100 ng·mL-1，作为标准曲线系列溶液。
2.2 甲基斑蝥胺给药取9周龄昆明小鼠6只，雌雄各半（由重庆市中药研究院实验动物研究中心提供，SCXK（渝）2012-0006），饲养3 d后禁食12 h，自由饮水，按照50 mg·kg-1剂量灌胃给药，另取昆明小鼠3只，给与0.5 %羧甲基纤维素钠溶液并作为空白对照组，两组分别于给药后120 min股动脉取全血500 mL于肝素钠化的EP管中，3 500 r·min-1离心10 min后取血浆备用。
为了研究甲基斑蝥胺在小鼠体内药代动力学，另取9周龄雄性昆明小鼠12只，饲养3 d后禁食12 h，自由饮水，按照50 mg·kg-1剂量灌胃给药，考虑到小鼠采血频率与采血量，将实验小鼠分2组，第1组分别于给药后0、0.5、2、4、12 h眼眶取血100 μL，第2组分别于给药后0.25、1、3、8、24 h眼眶取血100 μL，分别置于肝素钠化的EP管中，3 500 r·min-1离心10 min后取血浆备用。
2.3 样品处理与数据采集精密吸取小鼠体内代谢产物分析鼠血浆样品50 μL置1.5 mL EP管中，加入甲醇150 μL后于涡旋液体混合器上混匀2 min，以12 000 r·min-1离心10 min，取上清液3 μL进样，进行UPLC/Q-TOF MS分析，采用TOF-MS-Product Ion-IDA扫描方式进行数据采集。
精密吸取小鼠体内药代动力学分析血浆样品20 μL置0.5 mL EP管中，加入甲醇60 μL后于涡旋液体混合器上混匀2 min，以12 000 r·min-1离心10 min，取上清液3 μL进样，进行UPLC/Q-TOF MS分析，采用MRMHR方式进行数据采集，以m/z 210.11为母离子，以m/z 107.08为定量离子，误差范围为±0.01 Da。
2.4 色谱与质谱条件[15]色谱系统选用Kinetex XB-C18柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm），流动相为含0.1%甲酸的超纯水（A）-乙腈（B），采用梯度洗脱程序（起始B为10 %并持续1.00 min；1.00~8.00 min B变为80%，并持续至12.00 min；12.01 min B变为10 %并持续至15.00 min），流速为300 μL·min-1，柱温为30 ℃。
Triple TOF 4600高分辨质谱系统采用ESI离子源，采用Positive离子化方式；质量扫描范围m/z 100~1 000；鞘气为0.38 MPa，辅助气为0.38 MPa；气帘气为0.17 MPa，雾化温度600 ℃，采用TOF-MS-Product Ion-IDA或MRMHR方式扫描模式，TOF/MS一级预扫描和触发的二级扫描Product Ion-IDA离子累积时间分别为250、100 ms，采用多重质量亏损（MMDF）和动态背景扣除（DBS）作为二级触发条件，解簇电压80 V，CE碰撞能量为35 eV，CES碰撞能量叠加为（35±15）eV。
2.5 数据分析处理样品采用UPLC/Q-TOF数据采集软件Analyst（版本1.6.2，SCIEX公司）进行数据采集，该软件具备高分辨质谱数据的自动数据采集功能；代谢产物分析采用MetabolitePilotTM（版本1.2.1，SCIEX公司）进行代谢物分析鉴定软件进行自动化在线分析，该软件采用高分辨质谱数据，多重质量亏损技术，化合物基团与MS/MS自动比对等代谢物自动化识别，将化合物可能代谢物进行全面解析；定量数据采用MultiQuantTM（版本2.0，SCIEX公司）进行分析，该软件将高分辨数据导入后进行自动峰匹配与积分优化，自动输出目标化合物计算浓度数据；药代动力学数据采用DAS 3.0软件智能化药代动力学模块进行分析。
3 结果 3.1 UPLC/Q-TOF MS分析方法的建立为了建立基于UPLC/Q-TOF MS的甲基斑蝥胺分析方法，本研究首先对甲基斑蝥胺片中甲基斑蝥胺成分进行分析，并建立甲基斑蝥胺对照品分析方法。
采用软件自带色谱峰提取工具XIC manager，以甲基斑蝥胺精确相对分子质量（m/z 210.1125）进行提取（图 2），甲基斑蝥胺片中甲基斑蝥胺检测成分在3.743 min存在较强的信号，该信号与甲基斑蝥胺对照品出峰位置（3.779 min）一致。为确定该物质是否为甲基斑蝥胺，对其MS/MS碎片进行分析（图 3）。如图 3-A所示，甲基斑蝥胺在ESI-Positive模式中存在母离子m/z 210.112 6[M+H]+和同位素峰m/z 211.115 7[M+H]+，经电离作用产生特征碎片m/z 192.102 9，m/z 166.085 7，m/z 154.086 1，m/z 107.084 8（图 3-B）。通过MS/MS分析，甲基斑蝥胺片中存在该化合物，并作为甲基斑蝥胺分析方法参考依据。
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图 2 甲基斑蝥胺对照品（A）和甲基斑蝥胺片（B）中甲基斑蝥胺的选取离子流图 Figure 2 The extract ions using dialog (XIC) spectra of N-methylcantharidimide reference substances (A)and N-methylcantharidimide tablets(B) in positive ion mode |
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图 3 甲基斑蝥胺对照品的一级（A）和二级（B）质谱图 Figure 3 The MS(A) and MS/MS(B) spectra of N-methylcantharidimide in positive ion mode |
采用MRMHR方式对甲基斑蝥胺样品进行分析，其检测下限为1.5 ng·mL-1，定量下限为10.2 ng·mL-1，甲基斑蝥胺质量浓度在10.2~5 100 ng·mL-1范围内线性关系良好，以甲基斑蝥胺质量浓度（X）和对应峰面积（Y）绘制标准曲线，其线性方程：
Y=37.15X+894.3 r=0.999 8
对甲基斑蝥胺样品进行分析并计算药代动力学参数，结果见表 1。
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表 1 甲基斑蝥胺在小鼠体内的药代动力学检测分析结果 Table 1 The pharmacokinetic of N-methylcantharidimide of mice in vivo |
甲基斑蝥胺片给予小鼠120 min后，产生明显代谢产物（图 4）。
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图 4 空白组（A）和实验组（B）给药120 min后血浆样品的总离子流图 Figure 4 The TIC spectra of the plasma of blank (A) and experimental group (B) at 120 min in positive ion mode |
以甲基斑蝥胺为研究分析对象，借助MetabolitePilot软件，借鉴相关参考文献[14]，采用基于精确相对分子质量的多重质量亏损方法，对甲基斑蝥胺在小鼠体内的代谢物进行系统分析，发现甲基斑蝥胺去甲基、氧化、去甲基后氧化、双去甲基后氧化、去三甲基、去三甲基后氧化等在内的7种代谢产物，其生物转化过程（图 5）。
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图 5 甲基斑蝥胺在小鼠体内生物转化流程图 Figure 5 The flow diagram of biological transformation of n-Methylcantharidimide in mice |
甲基斑蝥胺在小鼠体内去甲基后产生m/z 196.096 8的代谢产物，经分析为N位去甲基，保留时间1.18 min，是甲基斑蝥胺在小鼠体内较为重要的代谢产物斑蝥胺，相关报道其具有重要的抗炎活性[16]。甲基斑蝥胺在小鼠体内发生氧化代谢，经分析为对称位置的C位（如图 5）。而甲基斑蝥胺在对称位置C位的甲基依然会发生去甲基化的反应，形成较多去甲基代谢物（去甲基、去甲基后氧化、双去甲基、双去甲基后氧化、去三甲基、去三甲基后氧化）。甲基斑蝥胺在小鼠体内代谢产物众多，如表 2所示。
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表 2 甲基斑蝥胺在小鼠体内代谢产物汇总 Table 2 Metabolites of biological transformation of N-methylcantharidimide in mice |
甲基斑蝥胺结构为斑蝥素O位甲氨基取代后的环氧异苯骈吡咯结构，存在对称的甲基和氧，因此代谢物相对简单。本实验以甲基斑蝥胺为研究对象，发现诸多甲基斑蝥胺氧化及去甲基代谢产物，通过与前期自建斑蝥体内成分标准图谱比较，均能够基本确定各自结构，例如氧化反应的C位（如图 5）。同时也发现一些有趣现象，例如发生双去甲基或双去甲基后氧化的代谢反应，其中脱掉的1个甲基首先会发生在N位，而另一个发生在对称的C位。
甲基斑蝥胺在体内存在较多代谢物成分，但是经由具体的代谢酶代谢研究暂无报道，本课题组在此研究基础上将深入开展相关工作，以期详细阐明甲基斑蝥胺详细的生物转化途径；此外，甲基斑蝥胺作为斑蝥素重要衍生物之一，与斑蝥素结构存在诸多相似之处，其生物转化过程在理论上存在与斑蝥素生物转化过程的重叠，而相似或相近的代谢产物或代谢中间体很可能对机体产生毒性或疗效，药物体内生物转化的评价对药物在临床的应用具有十分重要的参考价值。
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