药品杂质限度控制是药物质量标准研究的重要内容。近年来，国际上对药物杂质的遗传毒性越来越重视，EMA、美国FDA等先后颁布了遗传毒性杂质（genotoxic impurities，GTIs）控制的指导原则^[1-3]，2014年，ICH正式发布了M7指导原则：为控制潜在的致癌风险的DNA反应性（致突变性）药物杂质的评价和控制，对具有DNA活性（致突变性）的杂质的控制提出了通用的要求，目前已在各成员国药品注册中使用^[4]。根据国家药典会的研究项目安排，本实验室按照ICH M7指导原则的要求，采用（定量）构效关系计算机模型（（Q）SAR）技术对中国药典2015年版二部中收载的已知杂质进行了筛查，发现2个分类为1类的杂质，分别为左羟丙哌嗪的杂质缩水甘油（glycidol）、羟苯磺酸钙的杂质Ⅰ（氢醌，hydroquinone），并结合其质控限度的合理性，对遗传毒性杂质的评价和控制进行分析。

1 （Q）SAR评价软件 1.1 Derek

版本：Derek Nexus：5.0.1，数据库（Knowledge）：Derek KB 2015 1.0，数据库版本：1.0，数据库日期：2015年12月7日，英国Lhasa公司研制（http://www.lhasalimited，org/）。

Derek是经典的SAR毒理学预测软件，可以对包括遗传毒性、致癌性等在内的59个毒理学预测终点进行评价，并提供触发的警戒结构信息。Derek作为基于专家知识的评价系统用于杂质遗传毒性预测，在EMA、美国FDA相关指导原则中均为被推荐的软件之一。Derek用于杂质遗传毒性预测，基本设置为：物种设为细菌，预测终点设置为遗传毒性项下的致突变性。

1.2 Sarah

版本：Sarah Nexus：2.0.1，模型：Sarah Model 1.1.19，模型版本：2.0.1。英国Lhasa公司研制（http://www.lhasalimited，org/）。

Sarah是基于统计的（Q）SAR软件，主要是配合专家知识规则的软件，对药物杂质的致突变性进行预测。

1.3 Nexus

版本Nexus：2.1.0，英国Lhasa公司（http://www.lhasalimited，org/）旗下Derek、Sarah、Vitic、Meteor、Zeneth等软件的整合平台。

在Nexus系统中，使用Derek和Sarah进行遗传毒性评价，也可以分别使用2个软件。同时，Nexus系统中已固化了组合的ICH M7模式（ICH M7 Prediction），并能够采用ICH M7分类模式（ICH M7 Batch Classifcation）对杂质遗传毒性进行预测和分类。

2 评价方法和结果 2.1 评价方法

采用Chemdraw 12.0绘制药物活性成分（API）及杂质的化学结构图，分别为左羟丙哌嗪及其3个杂质右羟丙哌嗪、苯基哌嗪、缩水甘油（见图 1），羟苯磺酸钙及其杂质Ⅰ（氢醌）结构式（见图 2），输入Nexus 2.1.0（整合了Derek和Sarah等软件的综合软件）。

采用ICH M7模式和ICH M7分类模式，对左羟丙哌嗪及3个杂质、羟苯磺酸钙及其杂质Ⅰ进行遗传毒性预测。

2.2 结果

评价结果综合于表 1中。右羟丙哌嗪和苯基哌嗪Derek和Sarah预测结果均为阴性，分类为5类。缩水甘油Derek和Sarah预测结果均为阳性，ICH M7分类为1类。缩水甘油Derek预测触发的警戒结构为019环氧化物。在Sarah预测时，基于数据库中化合物结构精确匹配（已有文献资料）及表 2中所列3个支持性结构，缩水甘油遗传毒性阳性的可信度为100%。

氢醌Derek预测结果为阴性，Sarah预测结果为阳性，分类为1类。在Sarah预测时，基于数据库中化合物结构精确匹配（已有文献资料）及表 2中所列1个支持性结构，该化合物遗传毒性阳性的可信度为100%。

3 遗传毒性杂质控制的基本要求

根据杂质的诱变性和致癌性以及其应控制的措施，ICH M7指导原则将药物杂质分为5类，见表 3。

对于遗传毒性杂质的控制，M7指导原则引入了TTC（a threshold of toxicological concern）的概念，一个具有遗传毒性的杂质，每人每天摄入1.5 μg时其风险被认为可以忽略（终生暴露的情况下理论的患癌风险小于十万分之一）^[5]。一般长期用药（≥10年）的药物遗传毒性杂质，且无致癌试验数据（2类和3类），可以采用TTC作为默认的可以接受的标准。

根据TTC计算遗传毒性杂质限度公式如下（1 ppm相当于1 μg·g^-1）：

$ {\rm{杂质限度(ppm) = }}\frac{{{\rm{TTC}}(1.5{\rm{ \mathsf{ μ} g}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}})}}{{{\rm{每日剂量(g}} \cdot {{\rm{d}}^{ - 1}}{\rm{)}}}} $

另外，也可根据化合物特定的风险评估计算其可接受摄入量（acceptable intakes，AIs）。如对于有阳性致癌数据的杂质，可以采用线性计算方法；对于有实际阈值证据的遗传毒性杂质，可以根据其阈值计算日允许暴露量（permissible daily exposures，PDEs）等。2015年，ICH颁布了M7指导原则的增补（ICH M7 R1），对于15个（类）遗传毒性或致癌性明确的化合物进行了AIs或PDEs的计算和规定^[6]。其中包括缩水甘油，根据其TD₅₀计算AI为每天4 μg。

4 讨论

采用（Q）SAR评价通过警戒结构（structural alerts）预测化合物的遗传毒性已经有30多年的历史^[7]。ICH M7指导原则最显著的特点之一是引入了（Q）SAR评价的概念。对于杂质的遗传毒性评价，一般进行细菌的基因突变评价即可。M7指导原则中规定，应采用（Q）SAR技术对杂质毒性进行计算机评价，以预测细菌基因突变的结果。对于2B和3期临床试验的药品，申报时要提供一份（Q）SAR评估的杂质清单，所有实际存在或潜在的1、2、3类要提供控制方案。

不同于EMA和美国FDA以前对于遗传毒性杂质评价的要求，ICH M7要求使用两类互补的（Q）SAR评价体系，一类是基于专家知识规则的，另一类是基于统计学的。如果2个互补的（Q）SAR评价体系均没有发现警戒结构（评价结果为阴性），则足以说明该杂质没有遗传毒性，不需要进一步检测。无论哪类软件预测提示有警戒结构，均需要按照指导原则的程序进行杂质分类和控制。但可以经有经验的专家对（Q）SAR结果进行评价和解读，甚至推翻其结论^[8]。ICH M7是目前唯一将（Q）SAR评价结果作为以注册为目的的申报资料的最终结论的法规性文件。已有研究对包括Derek、Sarah等软件组合的预测效果进行评价^[9-10]，Derek和Sarah的组合符合OECD的认证体系，并为美国FDA等认可。

本次评价发现的2个遗传毒性阳性的杂质，实际上均为明确的致突变或致癌物质。缩水甘油，CAS号为000556-52-5，2000年被世界卫生组织下属的国际癌症研究所（IARC）列为2A类致癌物^{[11, 12]}。氢醌（hydroquinone），CAS号为000123-31-9，1999年被IARC列为3类致癌物^[13]。两者采用符合ICH M7指导原则的[Q]SAR模型评价结果均为阳性，且分类为1类，因此其质控限度应严格按照遗传毒性杂质的限度制定。

缩水甘油作为左羟丙哌嗪的杂质，左羟丙哌嗪为镇咳药^[14]，收载于中国药典2015年版二部和欧洲药典8.0，作为有关物质的限度分别为5 μg·g^-1和10 μg·g^{-1[15]156，[16]2610}。根据药品说明书，本品临床每日最大用量为180 mg（每次60 mg，每日3次）。按照上述标准，每日暴露量为0.9 μg（中国药典）和1.8 μg（欧洲药典），均低于ICH M7指导原则补充件规定的4 μg，因此其限度制定是合理的。

氢醌作为羟苯磺酸钙的杂质，羟苯磺酸钙为毛细血管保护药^[17]，也收载于中国药典2015年版二部和欧洲药典8.0，作为有关物质的限度均为0.1%^[15]1225，^[16]1733。本品临床1 d最大用量为3 g（每次1 g，每日3次）。按0.1%计算，每日暴露量为3 mg，该暴露量较高，存在较大的安全隐患，因此，建议从严修订羟苯磺酸钙中杂质Ⅰ（氢醌）的限值。如参考TTC（1.5 μg·d^-1）计算的限值，为0.5 ppm（μg·g^-1）。但TTC是一个高度保守的暴露量，另外，TTC一般用于2类、3类杂质的控制。对于1类杂质，一般通过文献资料或实验研究，提供充分的实验证据，根据其作用机制、50%致癌剂量（TD₅₀）、最大无毒剂量（NOEL）等数据计算可以接受的暴露量，然后计算杂质质量标准的限值。根据NIH公开的氢醌致癌性资料，氢醌致癌性TD₅₀为大鼠82.8 mg·kg^-1·d^-1、小鼠225 mg·kg^-1·d^-1[18]。按照ICH M7（R1）推荐的可接受摄入量（AI）计算公式^[6]：

$ {\rm{AI}} = {\rm{T}}{{\rm{D}}_{50}}/50\;000 \times 50{\rm{kg}} $

以82.8 mg·kg^-1·d^-1计算氢醌AI为82.8 μg·d^-1，对应杂质限度为27.6 ppm（μg·g^-1），因此，建议修订羟苯磺酸钙中杂质Ⅰ（氢醌）的限值为30 ppm（μg·g^-1）。当然，过于严格的标准会增加生产工艺的难度，提高生产成本，对于致突变杂质的控制还要考虑生产工艺和检测方法的可行性。