常见农药根据化学结构分为有机氯类、有机磷类和拟除虫菊酯类。有机氯类农药因其杀虫谱广、效率高而曾在20世纪50年代被广泛使用，其化学性质稳定、半衰期长、降解速度慢，可长时间残留在土壤中，且易通过食物链在生物体内蓄积，进而危害人体健康。虽然早已禁止使用，但由于该类农药残留时间长，以及药农的违规乱用，而致中药材尤其是根茎类药材往往会检出有机氯农残超标。中国药典2015年版(以下简称药典)通则2341收载了22种有机氯农药残留量测定法，测定目标物包括α-六六六、β-六六六、γ-六六六、δ-六六六、p，p′-滴滴伊、p，p′-滴滴涕、p，p′-滴滴滴、o，p′-滴滴涕、六氯苯、七氯、艾氏剂、狄氏剂、异狄氏剂、顺式氯丹、反式氯丹、五氯硝基苯、氧化氯丹、顺式环氧七氯、反式环氧七氯、α-硫丹、β-硫丹、硫丹硫酸盐^[1]。目前国内还没有该22种有机氯农药混合对照品溶液，国外标准物质价格昂贵，且由于涉及剧毒化学品，购买程序烦琐，周期长。本文针对药典通则有机氯农药残留量测定法2研制了22种有机氯混合对照品溶液(仅供中国药典有机氯农残测定法用)，以固体农药标准物质为原料，采用重量-容量法制备，采用气相色谱-电子捕获检测法(GC-ECD法)进行均匀性和稳定性检验，多家实验室协作标定进行定值，并对其特性量值进行了不确定度评估。

1 仪器与试药

气相色谱仪(Agilent 7890A)配ECD检测器)，电子天平(METTLER TOLEDO)，手动移液器(Eppendorf)；异辛烷(美国TEDIA，Fisher Scientific，农残级)，甲苯(分析纯)，50 mL量瓶，5 L量瓶中(北京计量院校准)。弹性石英毛细管柱(固定相：14%氰丙基苯-86%甲基硅氧烷；30 m×0.32 mm×0.25 μm；OPTIMA-1701；德国MN公司)。

量值溯源用对照品：异辛烷/甲苯中15种有机氯农药混合溶液(7+8)，(六氯苯210 ng·mL^-1(2.4%，扩展不确定度k=2以下同)、七氯208 ng·mL^-1(4.6%)、艾氏剂209 ng·mL^-1(4.4%)、狄氏剂208 ng·mL^-1(2.6%)、异狄氏剂208 ng·mL^-1(4.4%)、p，p′-滴滴伊210 ng·mL^-1(2.4%)、p，p′-滴滴涕209 ng·mL^-1(4.2%)、p，p′-滴滴滴208ng·mL^-1(4.2%)、o，p′-滴滴涕210 ng·mL^-1(4.2%)、α-六六六208 ng·mL^-1(2.4%)、β-六六六211 ng·mL^-1(4.2%)、γ-六六六210 ng·mL^-1(2.4%)、δ-六六六209 ng·mL^-1(2.4%)，中国计量科学研究院，批号12001)；顺式氯丹(99.0%，0.5%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 31125)；反式氯丹(98.0%，0.5%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 11216)；五氯硝基苯(100 ng·mL^-1，1.5%，中国计量科学研究院14001)；氧化氯丹(10 μg·mL^-1，2.0%，CHEM SERVICE 3485400)；顺式环氧七氯(10 μg·mL^-1，2.0%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 30108CY)；反式环氧七氯(10 μg·mL^-1，2.0%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 31122CY)；α-硫丹(10 μg·mL^-1，2.0%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 41111CY)；β-硫丹(10 μg·mL^-1，2.0%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 40121CY)；硫丹硫酸盐(10 μg·mL^-1，2.0%，LGC-Dr.Ehrenstorfer 41007CY)。扩展不确定度，k=2。

2 方法与结果 2.1 制备 2.1.1 单标储备液(0.5 mg·mL^-1)

分别精密称取22种对照品各50 mg±0.5 mg，加异辛烷溶解并定容至100 mL，对于难溶物质可加入适量甲苯。

2.1.2 候选标准物质溶液(10 μg·mL^-1)

将22种单标储备液完全转移至同一5 L量瓶中，用异辛烷充分洗涤各容量瓶，合并入5 L量瓶中，用异辛烷稀释至刻度，摇匀，避光、密闭、冷藏保存。

2.1.3 灌封

用有机型瓶口分液器分装至1 mL安瓿中，装量1.2 mL。封口过程中弃去前后各30支，分装，按顺序编号。

2.2 均匀性检验 2.2.1 色谱条件

弹性石英毛细管柱(30 m×0.32 mm×0.25 μm)MN-1701。进样口温度220 ℃，检测器温度300 ℃，分流比：50:1，流速为恒压模式(初始流速为1.5 mL·min-1)。升温程序：初始60 ℃，保持0.3 min，以60 ℃·min^-1升至170 ℃，以10 ℃·min^-1升至220 ℃，保持10 min，以1 ℃·min^-1升至240 ℃，以15 ℃·min^-1升至280 ℃，保持5 min。

2.2.2 取样

按照相关规定^[2-3]，对于均匀性好的样品，当总体单元数大于500时，抽取单元数不少于15个。分别在分装的初始、中间和终结阶段随机抽取5瓶，每瓶独立，重复测定3次，共计得到45个峰面积数据。

2.2.3 统计方法

采用单因素方差分析(ANOVA)方法，使用JMP12.0软件对结果进行评估，当P＞0.05时，表明样品均匀。以六氯苯为检测指标，将六氯苯的全部45个峰面积检验数据输入后，F检验结果如表 1所示，P=0.120 4，即P＞0.05，表明瓶间和瓶内无显著性差异，样品均匀。同理，其他待测目标物的均匀性检验结果均得到了样品均匀的结论。

2.3 短期稳定性检验 2.3.1 测定方法

同均匀性检验的测定方法。

2.3.2 取样

短期稳定性评估通常在不同温度条件下进行，以考察温度对于候选标准物质待定特性值的影响^{[2, 12]}。随机抽取18瓶样品，采用同步稳定性评估，对不同温度、不同时间点抽取的样品进行测定。

2.3.3 统计方法

采用趋势分析进行统计评估，稳定性评估基本模型公式为：

Y=β₀+β₁X；式中：β₀，β₁是回归系数；X是时间；Y是候选标准物质的特性值。

$ \text{斜率}\, {{\rm{ \mathsf{ β} }}_1} = \frac{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {\left( {{X_i} - \bar X} \right)\left( {{Y_i} - \bar Y} \right)} }}{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {{{\left( {{X_i} - \bar X} \right)}^2}} }} $

$ {{\rm{ \mathsf{ β} }}_1}{\rm{的标准偏差}}s\left( {{{\rm{ \mathsf{ β} }}_1}} \right) = \frac{s}{{\sqrt {\sum\nolimits_{i = 1}^n {{{\left( {{X_i} - \overline X } \right)}^2}} } }} $

$ {s^2} = \frac{{\sum\nolimits_{i = 1}^n {{{\left( {{Y_i} - {{\rm{ \mathsf{ β} }}_0} - {{\rm{ \mathsf{ β} }}_1}X} \right)}^2}} {\rm{ }}}}{{n = 2}} $

用t检验进行判断：若|β₁| < t_0.95，2·s(β₁)，则表明斜率不显著，没有观察到不稳定性。以六氯苯(20 ℃)为例，由表 2结果可知，β₁=0.005 95，t_0.95，2·s(β₁)=4.30×0.005 233=0.022 5，满足|β₁| < t_0.95，2·s(β₁)，说明样品在20 ℃避光条件下贮存30 d未发现不稳定性。同理，可认为本批有机氯混合对照品溶液在不超过40 ℃避光条件下短期放置稳定。由此确定有机氯混合对照品溶液的运输条件：温度不超过40 ℃；时间不超过30 d。

2.4 协作定值 2.4.1 正态性检验

采用多家实验室合作定值。每家实验室6瓶待测对照品，5家实验室共计30组数据。采用夏皮洛-威尔克(Shapiro-Wilk)法对原始数据进行正态性检验，结果表明22个特性值的数据均为正态分布。见表 3。

2.4.2 可疑值检验和等精度检验

先用格拉布斯法及狄克逊法进行组内可疑值检验，舍去异常值，然后用科克伦法检验各组数据平均值间是否等精度，结果表明各组数据等精度(表 4)。然后按组内可疑值检验方法检验各组数据平均值有无显著性差异。经检验：六氯苯、α-六六六和p，p′-滴滴滴的平均值有显著性差异，舍去异常值，其余各组数据平均值无显著性差异。

2.4.3 标准值的确定

除六氯苯、α-六六六和p，p′-滴滴滴之外的其余各组数据平均值无显著性差异的，求出总平均值，即为标准值；六氯苯、α-六六六和p，p′-滴滴滴的平均值存在显著性差异，在经技术审查确定剔除平均值存在差异的可疑数据组之后合并数据，求出总平均值，即为标准值^[3]。见表 5。

2.5 标准物质特性量值的不确定度的来源和分析^[10-14]

标准物质的特性量值的不确定度主要由不均匀性引起的不确定度、不稳定性引起的不确定度以及定值过程带来的不确定度三部分组成。将三部分不确定度分量按照平方和开方的方法进行合成，即得标准物质的合成标准不确定度u_CRM。u_CRM乘以包含因子k得到扩展不确定度或称总不确定度U。包含因子k取2，对应置信概率95%。

不均匀性引起的不确定度u_bb和不稳定性引起的不确定度u_s通过均匀性检验的方差分析结果和稳定性考察的变化趋势线可以计算得到。从短期稳定性结果未观察到明显不稳定性，参考已上市同类型农药对照品溶液的稳定性均为3~8年，由不稳定性带来的不确定度对标准物质的特性量值的不确定度贡献很小，因此予以忽略。从实验结果来看，有机氯农药混合对照品溶液特性量值的不确定度主要来自标准物质的定值过程带来的不确定度。见表 6。

对于标准物质，其定值过程不确定度评定程序为：建立待定特性量和其输入量之间的函数关系式(数学模型)，确定不确定度分量来源，量化不确定度分量。GC-ECD外标法测定溶液浓度的数学模型为C_s=(A_s×C_r×D_s)/(A_r×D_r)，式中A_s为样品峰面积；C_r为对照品标示量值；D_s为样品的稀释倍数；A_r为对照品峰面积；D_r为对照品稀释倍数。

定值过程引入的不确定度分为2个部分：A类不确定度和B类不确定度。A类是按统计方法计算出的不确定度；B类是通过对测量影响因素的分析，以非统计分析的方法评定的不确定度。

2.5.1 定值过程带来的不确定度的A类评定

标准物质的特性量值，由多个实验室，每个实验室测定n次，每个实验室的测定平均值为X_i，当测定数据服从正态分布，且X_i间等精度时，总平均值的标准不确定度，即不确定度的A类分量u_A用下式表示：

$ {u_{\rm{A}}} = {s_{\overline X }} = \sqrt {\sum\limits_{i = 1}^m {{{\left( {\overline X - \overline{\overline X} } \right)}^2}/m\left( {m - 1} \right)} } $

式中，s_X为总平均值的标准偏差X_i为各实验室的测定平均值；$\overline{\overline X}$为总平均值；m为参与定值的实验室数目。

2.5.2 定值过程带来的不确定度的B类评定

由测量的数学模型和对测量过程的分析，定值过程带来的B类不确定度主要来源于：溯源用对照品溶液标示量值引入的不确定度；溯源用对照品溶液和候选标准物质溶液稀释过程引入的不确定度；溯源用对照品溶液和候选标准物质溶液的色谱峰面积引入的不确定度。以六氯苯为例。

溯源用对照品溶液中六氯苯标示量值Cr的不确定度由标准物质证书上给出的扩展不确定度计算得到。2.4%/2=1.2%(k=2)。

由于使用了1 mL移液管和50 mL量瓶，候选标准物质溶液稀释过程D_s引入的不确定度包括以下三部分：其一，制造商提供的容量瓶和移液管体积的不确定度50 mL量瓶的容量允差为±0.05 mL，其标准不确定度u=0.05/$\sqrt 3$ =0.029 mL；1 mL移液管的容量允差为±0.007 mL，其标准不确定度u=0.007/$\sqrt 3$ =0.004 mL。其二，环境温度变化引入的不确定度忽略玻璃膨胀系数，异辛烷的体积膨胀系数为1.2×10^-3，假定温度相差±4 ℃；因温度产生的50 mL量瓶的体积变化为±50×4×1.2×10-3=±0.24 mL，按照均匀分布转化，则标准不确定度为0.24/$\sqrt 3$=0.14 mL；因温度产生的1 mL移液管的体积变化为，±1×4×1.2×10^-3=±0.004 8 mL，按照均匀分布转化，则标准不确定度为0.004 8/$\sqrt 3$ =0.002 8 mL。其三，充满量瓶至刻度的随机变化，50 mL量瓶充满10次并反复称量，由贝塞尔公式得出充满容量瓶至刻度的标准偏差为0.01 mL。同理，1 mL移液管充满至刻度的标准偏差可忽略。

由于溯源用标准物质溶液中六氯苯的浓度与样品接近，无需稀释，因此D_r引入的不确定度为零。

溯源用对照品溶液和候选标准物质溶液的色谱峰面积引入的不确定度主要来源于积分方式、积分参数和积分的重复性。由于不确定度较小，可以忽略。

合成上述各B类不确定度分量，六氯苯的的相对标准不确定度(B类)为0.013 3。将A类不确定度分量和B类不确定度分量进行合成，得到定值过程引入的相对不确定度u_char(表 7)。

$ {u_{{\rm{char}}}}{\rm{ = }}\sqrt {u_{\rm{A}}^2 + u_{\rm{B}}^2} $

3 讨论 3.1 浓度的选择

有机氯农残测定通常采用气相色谱-电子捕获检测器(GC-ECD)和气相色谱质谱联用仪(GC-MS)测定，具有非常高的灵敏度，达到10^-9甚至10^-12级。在标准物质的使用时，通常要进行稀释才能使用，而稀释次数越多，给测量结果带来的不确定度越大。因此本文选用了10 μg·mL^-1的浓度，一次稀释即可达到工作对照浓度，既可满足稳定性要求，实现量值的准确传递，并且也可制备成对照品储备液，降低使用成本^[9]。

3.2 溶剂的选择

与单一组分溶液标准物质相比，含22种农药组分的有机氯混合对照品溶液在选择制备溶剂时，要兼顾各农药组分在该溶剂中的溶解度和稳定性，同时参考国际和国内有机氯农药标准物质常用溶剂，最终选择了稳定、低毒的异辛烷。

3.3 色谱条件的优化

中国药典通则2341项下22种有机氯农残测定法规定分析柱使用50%苯基50%二甲基聚硅氧烷为固定液的弹性石英毛细管柱，实验证明DB-17分离度无法达到要求，不能满足标准物质定量的要求，通过色谱柱筛选，本文选用Optima-1701作为分析柱，并通过优化色谱条件，使分离度和保留时间均满足要求。

3.4 定值方式

标准物质的定值方式有5种^[2]，由单一实验室采用基准方法定值；由1个实验室采用2种或更多不同原理独立参考方法定值；使用1种或多种已证明准确性的方法，由多个实验室合作定值；利用特定方法进行定值；利用一级标准物质进行比较定值。根据标准物质的类型、最终使用要求、相关实验条件方法的性能指标以及与特性值相关的不确定度的实际评估能力来适当选择定值方法。本品同时采用了多家实验室合作定值方式，同时参考了重量-容量法的定值结果，2种方法结果差异不大，小于3%，表明以外标法多个实验室合作定值结果准确可靠。

3.5 关于稳定性

由于样品短期内是稳定的，且暂缺乏长期稳定性监测数据，无法将标准物质的不稳定性引入的不确定度合成到总不确定度中，此项需日后补充长期稳定性数据后再行完善。