2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 山西中医药大学, 晋中 030619;
3. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. Shanxi University of Traditional Chinese Medicine, Jinzhong 030619, China;
3. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
蜂蜜是蜜蜂将采集的植物花蜜、蜜露或甘露，与自身唾液腺的分泌物结合后，经充分酿制而储藏在巢脾内的天然甜物质[1]。蜂蜜作为传统中药丸剂中的辅料，不仅具有黏合剂、矫味剂的作用，而且具有补中、润燥、解毒的功效，其主要成分为果糖和葡萄糖[2-3]，约占70%以上[4]。5-羟甲基糠醛(5-hydroxymethyl furfural，5-HMF)是已糖经加热分解产生的降解物[5-6]，在新鲜蜂蜜中含量很低[7]。据报道，该化合物可引起动物横纹肌麻痹及内脏损害[8]，具有基因毒性和细胞毒性[9]和潜在的致癌风险[10]。蜂蜜国家标准(GB 18796—2005)[11]采用高效液相色谱法测定5-HMF的含量，规定应小于或不得过40 mg·kg-1。GB/T 18932.18-2003[12]规定了5-HMF测定的具体方法。5-HMF性质不稳定，熔点30~34 ℃，极易潮解，高于30 ℃难以准确称量。本文参照国家标准方法，以鸟苷为内标物，建立了校正因子法测定蜂蜜中5-HMF的含量。
1 仪器与试药沃特世公司Waters 2695高效液相色谱仪(2998PDA检测器)；安捷伦公司1260型液相色谱仪、二极管阵列检测器。安捷伦公司Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)。
5-羟甲基糠醛对照品(批号111626-201007)由中国食品药品检定研究院提供，鸟苷(纯度≥98%，批号060M16899V)购自SIGMA公司；样品购自北京、湖南、四川、陕西等地；乙腈、甲醇为色谱纯(Fisher公司)，其余均为分析纯(北京化工厂)。
2 溶液的制备 2.1 对照品储备液与内标储备液精密称取5-羟甲基糠醛对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加10%甲醇溶液溶解并稀释至刻度，即得对照品储备液。精密称取鸟苷对照品10 mg，置50 mL量瓶中，加10%甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液。
2.2 供试品溶液取蜂蜜1 g，置烧杯中，精密称定，加10%甲醇溶液约10 mL溶解并转移至50 mL量瓶中，分3次洗涤容器，每次约3 mL 10%甲醇溶液，洗液并入量瓶中，精密加入鸟苷内标储备液1 mL，加10%甲醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。
3 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：乙腈-0.1%甲酸水溶液(5:95)；流速：0.8 mL·min-1；检测波长：284 nm(5-HMF)、254 nm(鸟苷)；柱温：35 ℃；进样量：10 μL。在上述色谱条件下，样品及对照品色谱图见图 1。
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1.鸟苷(guanosine)2. 5-HMF 图 1 加内标对照品(A)、加内标阳性样品(B)、不加内标阴性样品(C)色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substance and internal standard (A), sample and internal standard (B), negative sample without internal standard(C) |
取内标储备液0.5、1.0、2.0、3.0、5.0 mL，分别置100 mL量瓶中，再分别加入对照品储备液2.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀，分别取10 μL进样测定。以鸟苷与5-HMF的质量浓度比值X为横坐标，以两者的峰面积比值Y为纵坐标，进行线性回归。鸟苷/5-HMF不同浓度比值(0.34~3.46)与峰面积比值的线性关系良好(r=0.999 9)，回归方程：
Y=0.309 9X-0.006 2 r=0.999 9
分别采用Waters 2695-2998及Agilent 1260这2种高效液相色谱系统，Agilent TC-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)及Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)3种色谱柱，重复进行5次试验，以不同质量浓度比值与峰面积值计算校正因子，校正因子平均值(n=5)为0.339 9，RSD=3.3%。
4.2 重复性试验取蜂蜜样品1 g共6份，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，进样测定，以外标法及校正因子计算5-HMF平均含量(n=6)分别14.48mg·kg-1和14.23 mg·kg-1，RSD均为1.3%。
4.3 回收率试验取蜂蜜样品0.5 g共6份，精密称定，分别加入5-HMF对照品溶液(0.146 6 μg·mL-1)50 mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，进样测定，计算回收率。结果见表 1。
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表 1 回收率试验结果(n=6) Table 1 Results of recovery test |
采用3种不同商品规格的C18色谱柱[Agilent TC-C18 (4.6 mm×250 mm，5 μm)、Agilent ZORBAX SB-C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)、Phenomenex C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)]分别测定同一样品的含量，比较不同色谱柱对测定结果的影响，结果RSD为2.4%，表明校正因子法测定样品含量在采用不同品牌及不同型号色谱柱时具有良好的耐用性。
4.4.2 流动相pH变化的影响分别采用0.07%、0.10%和0.13%甲酸为流动相中的水相，测定同一样品的含量，比较改变流动相pH对含量的影响，结果RSD为1.6%，表明校正因子法测定样品含量在不同pH的流动相条件下具有良好的耐用性。
4.5 检测限与定量限的测定取“4.1”项下线性最低点的溶液，逐步进行稀释，然后进样，以信噪比方法测定，3倍噪音时的检测限为0.01 μg·mL-1，10倍噪音时定量限为0.03 μg·mL-1。
5 样品测定取21批样品，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液；分别精密吸取供试品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪进行测定。采用外标法和校正因子法计算蜂蜜中5-HMF的含量，结果见表 2。使用SPSS 18.0统计软件对采用外标法和校正因子法测得的结果进行配对t检验，结果2种含量测定方法差异无统计学意义(P=0.411)。
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表 2 蜂蜜样品中5-HMF的测定结果(mg·kg-1) Table 2 Determination results of 5-HMF in honey |
查阅相关文献以及5-HMF的溶液的配制条件，因鸟苷熔点高，易溶解于10%的甲醇溶液中，保留时间适中，峰形良好，与蜂蜜中其他成分分离度较好，不干扰测定，因此选择鸟苷作为5-HMF测定的内标物。
6.2 蜂蜜中5-HMF含量结果分析按GB 18796—2005《蜂蜜》标准，蜂蜜中5-HMF不得过40 mg·kg-1，测定的样品中，10批超过限度。5-HMF超出限度者可能与蜂蜜存储时间和存储环境有关[13]。炼蜜中5-HMF含量一般较高，可能与炼制过程有关，在炼制的过程中由于高温加热产生更多的5-HMF[14]。
7 小结采用校正因子法所得蜂蜜中5-HMF含量与常规的外标法所得的含量间无显著差异(P=0.411)，说明在无对照品的情况下，通过校正因子法测定蜂蜜中5-HMF含量准确可行。
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