中药注射剂是从中药材中提取、纯化有效成分后，经人工配制成的溶液、乳液、粉末或浓溶液无菌制剂^[1]。中药注射剂的不良反应报告逐年增多，尤以过敏反应居多，虽然其致敏机制尚无定论，但注射剂中所含的蛋白质等可作为致敏源进而引发过敏反应的观点已经得到广泛认可^[2-5]。中药注射剂中蛋白质的检查始于2000年版中国药典一部^[6]，直至最新的2015年版中国药典均明确规定，中药注射剂除另有规定外，均应对蛋白质进行检查。现2015年版中国药典采用磺基水杨酸比浊法检查中药注射剂中的蛋白质^[7]，该法虽简单易行、快速直观，但灵敏度低，专属性差，常会出现假阳性干扰，如不饱和脂肪酸、环状饱和脂肪酮等中药有效成分和聚山梨酯、司盘等增溶剂都会造成假阳性结果^[8-11]。因此，建立杂质蛋白灵敏、准确的检测方法已成为中药注射剂质量控制亟需解决的难题之一。

段为刚^[12]建立了一种滤过吸附法，采用PDVF膜吸附微量蛋白质后，用考马斯亮蓝进行显色。该方法检测限低，不足之处在于需要特制的小空滤器装置。王雪^[13]将4种常用的蛋白质测定方法应用于中药注射剂中大分子蛋白的检查，结果表明，磺基水杨酸法灵敏度不高，考马斯亮蓝法和福林酚法专属性较差，体积排阻色谱法灵敏度和专属性相对良好。

凝胶过滤色谱法(gel filtration chromatography，GFC)是20世纪60年代发展起来的一种色谱分离方法。其以多孔凝胶作固定相，依据样品分子量大小达到分离目的^[14]。近年来，凝胶色谱法准确性高，重现性好，自动化程度高，科学快速，能真实表示出蛋白质和肽类的分子量分布，可以分析鉴定产品纯度，被广泛应用于蛋白质的分离和检测工作中。

针对中药注射剂中各成分性质差异大，组成复杂等特点，本实验建立了葡聚糖凝胶色谱法(sephadex chromatography，SC)与凝胶高效液相色谱法(gel high performance liquid chromatography，Gel-HPLC)相结合的两步凝胶色谱法限量检查中药注射剂中大分子蛋白，并与中国药典规定方法进行了对比。为更快速、准确地检测中药注射剂中大分子蛋白提供了新方法，从而为中药注射剂更准确、全面地质量控制提供实验参考。

1 仪器与试药 1.1 仪器

BS110S型电子天平(d=0.1 mg，北京赛多利斯仪器系统有限公司)；SZ-97型三重自动蒸馏水机(上海亚荣生化仪器厂)；WGZ-1型浊度计(上海昕瑞仪器仪表有限公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)。HL-2S恒流泵(上海沪西分析仪器有限公司)；HD-4电脑核酸蛋白检测仪(上海沪西分析仪器有限公司)。

Waters 1525高效液相色谱仪(美国Waters公司)；Waters 2998二极管阵列检测器；Waters 2707自动进样器；Waters 038040柱温箱；Breeze 2 HPLC色谱工作站。

1.2 试药

双黄连注射液(黑龙江省格润药业有限责任公司；批号：20120906、20130314)；天麻素注射剂(济南利民制药有限责任公司；批号：12110939、12070815)；舒血宁注射液(黑龙江珍宝岛药业股份有限公司；批号：B20130115294、B20130115124、B20141109126)；疏血通注射液(牡丹江友搏药业股份有限公司；批号：15032011、15032017)；丹红注射液(山东丹红制药有限公司；批号：15041008、15091014、15091022)；红花注射液(山西卫华药业有限公司；批号：14111111)；血塞通注射液(云南白药集团股份有限公司；批号2BA1524)；血塞通注射液(昆明制药集团股份有限公司；批号14FJ204-21)；痰热清注射液(上海凯宝药业股份有限公司；批号：1502310、1507201、1506210)。

5-磺基水杨酸(国药集团化学试剂有限公司；批号：20130408)；牛血清蛋白(美国Sigma公司，批号：0332)；溶菌酶(Biodee生物集团有限公司，编号：0663)；SepHadex G-25(GE Healthcare公司)；聚山梨酯-80(南京威尔化工有限公司；批号：20130701)；溶菌酶(美国Sigma公司，编号：L6876-1G)；95%乙醇、85%磷酸、十二水合磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、硫酸钠均为分析纯，购于北京化工厂；本实验用水均为三重蒸馏水。

2 方法与结果 2.1 交联葡聚糖凝胶柱色谱分析法 2.1.1 洗脱液的配制

称取十二水合磷酸氢二钠35.8 g，用三重蒸馏水定容至1 000 mL量瓶中。称取磷酸二氢钠15.6 g，用三重蒸馏水定容至1 000 mL量瓶中。将2种溶液等比例混合即得洗脱液。

2.1.2 供试品溶液的配制

将溶胀好的SepHadex G-25加洗脱液配制成含75%凝胶的混悬液，沿色谱柱内壁缓慢匀速地将混悬液倒入色谱柱中，用3~5倍柱体积的洗脱液以3 mL·min^-1左右的速度平衡色谱柱，使其稳定。精确吸取1.0 mL的中药注射剂溶液进样，以1.0 mL·min^-1的流速恒流洗脱；连接核酸蛋白检测仪，记录色谱柱洗脱液在280 nm处的紫外吸收信号，色谱图见图 1。同时连接自动收集器，弃去前5 mL洗脱液，收集接下来的20 mL洗脱液，定容至25 mL量瓶中。该溶液即第二步凝胶高效液相色谱法的供试品溶液，进样前过0.45 μm微孔滤膜。

2.2 凝胶高效液相色谱法 2.2.1 溶菌酶对照品溶液的配制

精密称取溶菌酶对照品5.0 mg，置5 mL棕色量瓶中，加三重蒸馏水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得1 mg·mL^-1的溶菌酶对照品溶液。将该溶菌酶对照品溶液作为母液，根据实验需要，依次用洗脱液稀释至所需浓度，用前过0.45 μm微孔滤膜。

2.2.2 溶菌酶对照品限量溶液的配制

精密吸取200 μL溶菌酶对照品母液，置250 mL棕色量瓶中，用洗脱液定容，摇匀，即得0.8 μg·mL^-1的溶菌酶对照品限量溶液，用前过0.45 μm微孔滤膜。该溶液的浓度作为本实验中药注射液中大分子蛋白检查得限量浓度。

2.2.3 色谱条件

色谱柱：TSK-Gel G2000SWXL(7.8 mm× 300 mm，5 μm)；流动相：0.1 mol·L^-1硫酸钠和0.1 mol·L^-1磷酸缓冲盐等体积混合液(pH 6.7)；流速：0.8 mL·min^-1；进样量100 μL；检测波长：280 nm；柱温：25 ℃。色谱图见图 2。

2.2.4 溶菌酶对照品线性关系考察

分别精密吸取10 μg·mL^-1和200 μg· mL^-1的溶菌酶对照品溶液5、10、20μL，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定。以溶菌酶对照品的进样量为横坐标，相应峰面积为纵坐标绘制标准曲线，得线性回归方程：

Y=1.765 ×10⁵X-4 717.8   R²=0.999 0

表明溶菌酶对照品在0.05~4 μg的范围内，进样质量与峰面积的线性关系良好。

2.2.5 检测限和定量限

精密吸取浓度为5 μg·mL^-1和10 μg·mL^-1的溶菌酶对照品溶液各5 μL，按“2.2.2”项下色谱条件进行检测。采用信噪比法确定溶菌酶标准蛋白的检测下限(S/N≥3)和定量下限(S/N≥10)分别为5 μg·mL^-1和10 μg·mL^-1。

2.2.6 精密度试验

精密称取浓度为10 μg ·mL^-1的溶菌酶对照品溶液10 μL以及200 μg·mL^-1的溶菌酶对照品溶液5 μL和20 μL，按“2.2.2”项下色谱条件进行检测，上述3个进样浓度均连续进样测定6次，三者峰面积的RSD分别为1.7%、1.4%、1.1%，表明仪器精密度良好。

2.2.7 稳定性试验

精密吸取浓度为10 μg·mL^-1的溶菌酶对照品溶液10 μL以及200 μg·mL^-1的溶菌酶对照品溶液5 μL和20 μL，按“2.2.2”项下色谱条件进行检测。在3种进样量下，依次检测其在0、2、4、6、12、24 h时的峰面积和保留时间。由低到高3个进样浓度对应的峰面积RSD为3.0%、2.3%、2.3%，三者保留时间的RSD分别为1.1%、0.73%、0.50%，表明待测物质在24 h内稳定性良好。

2.2.8 重复性试验

分别精密吸取25 μg ·mL^-1、250 μg·mL^-1和1 mg·mL^-1的溶菌酶对照品溶液100 μL，按“2.2.2”项下色谱条件进行测定。由低到高3个浓度的色谱柱保留时间的RSD分别为2.8%、1.7%、1.2%，三者TSK柱峰面积的RSD分别为3.0%、2.3%、1.5%，表明两步凝胶法的重复性良好。

2.2.9 回收率试验

精密称取3组一定量溶菌酶对照品，一式3份，分别用洗脱液溶解配制成浓度为20、40和80 μg·mL^-1的溶菌酶标准溶液，作为待测标准溶液。

将3种浓度的待测标准溶液按“2.1.2”项下方法制备相应供试品溶液，并按“2.2.2”项下色谱条件，进样100 μL进行检测。结果显示，3种浓度下溶菌酶对照品的回收率分别为83.4%、91.6%、91.7%；RSD分别为1.6%、2.3%、2.6%，平均回收率为88.9%，表明两步凝胶法回收率良好。

2.2.10 样品测定

精密吸取中药注射液1 mL，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，并按“2.2.2”项下色谱条件进样100 μL进行检测。将样品峰面积与溶菌酶对照品限量溶液的峰面积(19223)进行比较，每个批次的中药注射剂样品均平行操作2次进行测定。样品图中未出现色谱峰或色谱峰的峰面积小于限量对照品溶液的峰面积，即认为该中药注射剂样品合格。本实验共检测了分属8个不同品种的18个批次的中药注射剂中的大分子蛋白，检测结果见表 1。

3 讨论 3.1 两步凝胶法原理

本实验为实现中药注射剂中大分子蛋白精确、快速地检测，建立了两步凝胶法，其第一步采用交联葡聚糖凝胶色谱法来分离中药注射剂中的大分子蛋白组分，同时核酸蛋白检测仪对洗脱组分在280 nm处的吸收进行监测。中药注射剂中大分子蛋白质极有可能为中药注射剂中的致敏性物质，而部分中药注射剂中的有效成分为小分子多肽，为了排除小分子肽类成分的干扰，本实验以分子量为14.3 KD的溶菌酶出峰时间作为是否为大分子蛋白质的分界点，在第一步中通过收集分界点之前的洗脱液，保证所得洗脱组分中尽可能不含小分子物质。第二步采用凝胶高效液相色谱法，通过选择合适分离范围的凝胶色谱柱，对第一步所得洗脱液进行了某一分子量范围内的半定量分析，从而实现了中药注射剂中大分子蛋白质的准确检测。

3.2 蛋白质限量设定

磺基水杨酸比浊法为现行药典中检查中药注射剂中蛋白质的方法，文献报道^[11]该方法的检测限为40 μg·mL^-1，然而20 μg蛋白质足以引发免疫反应(如，乙肝疫苗的成人一次免疫量为20 μg)，因此药典方法的检测限明显偏高^[15]。本实验以限量对照品溶液的蛋白质含量作为中药注射剂的大分子蛋白的检查限量。人为设定限量对照品溶液的浓度为0.8 μg·mL^-1，在样品测定过程中，1 mL中药注射液被稀释了25倍，即相当于中药注射液中大分子蛋白的限量值为20 μg·mL^-1。因此本实验所建立的两步凝胶法具有更高的灵敏度。

3.3 样品检测结果分析

本实验同时采用中国药典磺基水杨酸比浊法对中药注射剂样品进行了检测，其结果表明8种中药注射剂中只有痰热清注射剂产生了浑浊反应。有文献报道，磺基水杨酸比浊法在检测痰热清注射液时，易产生假阳性现象，存在一定典型性^[9]。本实验选取了市售8个不同品种共18个批次的中药注射剂进行检测，检测结果发现，不同中药注射剂品种中均能检出大分子蛋白的存在，虽含量略有差别，但均符合本实验设定的20 μg·mL^-1的检查限量。不同种类中药注射剂中的大分子蛋白色谱峰的保留时间略有差异，但均与溶菌酶保留时间接近，表明市售中药注射剂中残留的大分子蛋白分子量范围接近，磺基水杨酸比浊法的实验结果同两步凝胶法的检测结果基本一致，也说明了本实验建立方法的可靠性。

4 结论

目前中药注射剂中蛋白质的检查主要采用磺基水杨酸比浊法，但由于中药注射剂中成分比较复杂，可能会干扰该方法的准确性，使结果出现假阳性或假阴性情况。为了解决该问题，本实验建立了两步凝胶法限量检查中药注射剂中的大分子蛋白质。该方法整体上包括2个步骤，第一步利用交联葡聚糖凝胶柱实现注射剂中大分子蛋白的分离，第二步利用凝胶高效液相色谱法检测大分子蛋白的含量，并人为设定了20 μg·mL^-1的大分子蛋白限量。本实验分别用磺基水杨酸比浊法和两步凝胶法检测了市售的8个不同品种18个批次的中药注射剂，2种方法的检测结果基本一致。本实验建立的两步凝胶法检测限低，灵敏度较高，稳定性良好，检测结果可靠，可以用于中药注射剂中杂质蛋白的含量测定。本实验方法虽然相较中国药典方法烦琐，但操作相对简单，专业性要求较低，检测耗时较短。本方法解决了中国药典方法的假阳性问题，为中药注射剂中大分子蛋白检查提供了更有效的方法，为进一步保证中药注射剂的药品质量和临床用药安全奠定了基础。