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  药物分析杂志   2018, Vol. 38 Issue (2): 307-312.  DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.02.17
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生物检定

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段徐华, 尹红锐, 吴利红, 邵泓, 陈钢. 应用酶联免疫法测定人免疫球蛋白类制品中IgA含量[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(2): 307-312. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.02.17.
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DUAN Xu-hua, YIN Hong-rui, WU Li-hong, SHAO Hong, CHEN Gang. Quantification of immunoglobulin A in human immunoglobulin products by enzyme-linked immunosorbent assay[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(2): 307-312. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.02.17.
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第一作者

段徐华, Tel:(021)50798177, E-mail:duanxuhua109@163.com;
尹红锐, Tel:(021)50798177, E-mail:13918977564@163.com。

通信作者

陈钢, Tel:(021)50798176, E-mail:chengang@smda.org.cn

文章历史

收稿日期：2016-12-14
Contents              Abstract              Full text              Figures/Tables              PDF
应用酶联免疫法测定人免疫球蛋白类制品中IgA含量
段徐华 , 尹红锐 , 吴利红 , 邵泓 , 陈钢     
上海市食品药品检验所, 上海 201203
收稿日期：2016-12-14
第一作者：段徐华, Tel:(021)50798177, E-mail:duanxuhua109@163.com
尹红锐, Tel:(021)50798177, E-mail:13918977564@163.com
通信作者：陈钢, Tel:(021)50798176, E-mail:chengang@smda.org.cn
摘要：目的：建立人免疫球蛋白类制品中免疫球蛋白A（IgA）含量测定的酶联免疫（ELISA）方法。方法：使用筛选出的ELISA检测试剂盒和IgA国际标准品，建立IgA含量测定的ELISA方法并进行方法学验证，使用验证的方法对来自不同企业的22批静注人免疫球蛋白（pH 4）中IgA含量进行测定。结果：建立的方法在1.562 5×10-3~2.5×10-4 IU·mL-1范围内线性良好（r=0.996 3）；与IgG1类单抗药物未显示交叉反应；定量限为2.167×10-4 IU；含不同辅料的2种处方平均加标回收率分别为102.2%和98.5%；重复性和中间精密度RSD均小于10%；高、中、低浓度样品使用不同批号试剂盒测定结果RSD均小于10%。由于生产工艺不同，各家企业所生产的静注人免疫球蛋白（pH 4）中IgA含量各不相同，经纯化的产品IgA含量更低。结论：该检测方法具有快速、灵敏、操作简便等特点，可用于人免疫球蛋白类制品的质量控制。
关键词：酶联免疫法    IgA    含量测定    人免疫球蛋白    生物制品    药物质量控制    
Quantification of immunoglobulin A in human immunoglobulin products by enzyme-linked immunosorbent assay
DUAN Xu-hua, YIN Hong-rui, WU Li-hong, SHAO Hong, CHEN Gang    
Shanghai Institute for Food and Drug Control, Shanghai 201203, China
Abstract: Objective: To establish an enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)method for quantification of immunoglobulin A(IgA)in human immunoglobulin products.Methods: A screened ELISA kit and the WHO International Standard(Immunoglobulins G, A and M, Human Serum)were used to set up the ELISA method for quantification.22 batches of human immunoglobulin for intravenous injection(pH 4)from different manufacturers were analyzed using the verified method.Results: The established method demonstrated good linearity in 1.562 5×10-3-2.5×10-4 IU·mL-1(r=0.996 3)without cross-reaction with other immunoglobulins G1 products.The limit of quantitation was 2.167×10-4 IU.The average recoveries for two formulations with different excipients were 102.2% and 98.5%, respectively.The RSD of repeatability and intermediate precision were both lower than 10%.The ELISA kit also showed good lot-to-lot uniformity with RSD < 10% in analyzing different batches of samples at different concentrations.In addition, due to different manufacturing processes, the contents of IgA were different in 22 batches of samples and lower in purified samples.Conclusion: The method is quick, sensitive and convenient, and it can be applied to quality control of human immunoglobulin products.
Key words: enzyme-linked immunosorbent assay(ELISA)    immunoglobulin A(IgA)    quantitative analysis    human immunoglobulin    biological products    pharmaceutical quality control    

选择性IgA缺乏症(Selective Immunoglobulin A deficiency，SIgAD)是一种较为常见的原发性免疫缺陷病，占原发性免疫缺陷病的60%以上[1]。当SIgAD患者输入含有微量IgA的人免疫球蛋白类制品后可产生抗IgA的抗体，当再次输入该类制品时可产生严重的过敏反应，甚至危及患者生命，因此，严格控制人免疫球蛋白类生物制品药物中杂质IgA的含量具有积极的临床意义。目前，中国药典所收载的人免疫球蛋白类制品并没有检测IgA含量的要求，国外药典也只是提出采用合适的免疫化学方法，并没有介绍具体的检测方法。据文献报道，IgA含量测定方法有酶联免疫法[2-4]、免疫比浊法[5-7]、琼脂单向免疫扩散法[8]和火箭免疫电泳法等[9-13]多种方法。其中，酶联免疫法(enzyme-linked immunosorbent assay，ELISA)由于其简便、快速、灵敏、精确等优点而被广泛使用。我们以目前人免疫球蛋白类制品中生产量最大、风险性更高的静注人免疫球蛋白(pH 4)为研究对象，建立了可用于该类制品中IgA含量测定的ELISA方法，并应用此方法对来自全国不同企业的22批静注人免疫球蛋白(pH 4)样品中的IgA含量进行了检测。

1 仪器与试剂 1.1 仪器

Versa max型酶标仪(美国Molecular Devices公司)；隔水式恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司)；移液器(德国Eppendorf公司)；Milli-Q超纯水仪(美国密理博公司)。

1.2 试剂

IgA ELISA定量检测试剂盒(批号：314873、315630、316809，美国ZeptoMetrix Corporation(ZMC)生产)；IgA国际标准品(来源：NIBSC，批号：67/086，规格：每支100 IU)；静注人免疫球蛋白(pH 4)分别来自22家企业，每家企业各1批样品，包括山梨醇和麦芽糖2种辅料的处方；水为Milli-Q超纯水制备系统处理的去离子水。

2 方法与结果 2.1 方法建立与验证 2.1.1 标准曲线的建立取

国际标准品1支，加水1 mL复溶，浓度为100 IU·mL-1。取复溶后标准品溶液，用试剂盒中稀释液定量稀释制成浓度为1.562 5×10-3、3.125×10-3、6.25×10-3、1.25×10-4、2.5×10-4 IU·mL-1的溶液，按照试剂盒说明书中步骤进行测定。以标准品溶液IgA浓度的对数对其相应的吸收度作直线回归，求得回归方程：

Y=1.668 6X-0.035 97 r=0.996 3

在1.562 5×10-3~2.5×10-4 IU·mL-1浓度范围内，标准品溶液吸收度与IgA浓度的对数呈良好线性。

2.1.2 专属性考察

取主成分为IgG1的3种单抗(西妥昔：批号141308；托珠：批号B1017；阿达木：批号49058LX03)原液进行测定。结果3种单抗的吸光度分别为0.006、0.008和0.098，与试剂盒中稀释液吸光度(0.007)接近，说明交叉反应少，该方法的专属性好。

2.1.3 定量限考察

取试剂盒中稀释液10份，按照试剂盒说明书中步骤进行测定，计算其吸光度值的均值(X)和标准差(σ)分别为0.050和0.002。以吸光度值均值X+10σ代入标准曲线计算对应的IgA含量作为定量限。计算获得定量限为2.167×10-4 IU。

2.1.4 回收率试验

采用加标回收率法，取复溶后标准品溶液分别稀释至3.125×10-3、6.25×10-3和1.25×10-4 IU·mL-1，将供试品溶液也分别稀释至浓度约为3.125×10-3、6.25×10-3和1.25×10-4 IU·mL-1，再将标准品和供试品浓度相当的溶液按体积比1:1进行混合，分别制成3个浓度水平的样加标混合溶液，每个浓度制备3份，按照试剂盒说明书中步骤进行测定。按上述方法，对2种处方的供试品溶液(处方1：批号为20150503Z，辅料为麦芽糖；处方2：批号为201504G007，辅料为山梨醇)分别进行考察。按以下公式：回收率(%)=(加标样品测定浓度×2-供试品测定浓度)/加入的标准品浓度×100%计算回收率，结果见表 1。处方1和处方2样品不同浓度水平的平均加样回收率(n=9)分别为102.2%和98.5%。结果表明该方法受样品基质影响小，能够准确测定静注人免疫球蛋白(pH4)中IgA的含量。

表 1 回收率测定结果 Table 1 Determination results of recoveries
2.1.5 精密度试验

取“2.1.4”项下加标混合溶液进行重复性考察，结果见表 2，不同处方样品低、中、高3个浓度水平测定值的RSD(n=3)均小于10%，表明该方法重复性好。

表 2 重复性测定结果 Table 2 Determination results of repeatability

取供试品溶液(批号201504G007)，由2名分析人员在不同日期分别进行测定，每人每次测定3份，结果详见表 3，RSD < 10%(n=18)，表明该方法中间精密度好。

表 3 中间精密度测定结果 Table 3 Determination results of intermediate precision
2.1.6 耐用性

为了考察试剂盒的批间一致性，选取低、中、高浓度供试品各1批，分别采用2个批号的试剂盒进行测定，每批样品重复测定3份，结果详见表 4。结果显示低、中、高浓度的供试品采用不同批号试剂盒检测时测定值的RSD均小于10%(n=6)，表明方法的耐用性良好。

表 4 不同浓度样品采用不同批号试剂盒检测的测定结果 Table 4 Determination results of samples at different concentration using ELISA kits with different batch numbers
2.2 样品测定

取来自不同企业的22批静注人免疫球蛋白(pH 4)样品，用试剂盒中稀释液定量稀释制成适当浓度，使IgA含量在标准曲线范围内，采用上述经验证的方法进行测定，结果见表 5和图 1。根据测定结果可以发现，大多数企业生产的静注人免疫球蛋白(pH 4)中IgA含量在10 IU·mL-1以下，但是也有个别企业达到甚至超过了14.1 IU·mL-1(目前国外产品中的最高限度)，且具备纯化步骤的生产工艺所生产的样品IgA含量明显低于未经纯化的样品测定值(表 5中厂家1~9生产工艺具备纯化步骤，其他厂家生产工艺均无纯化步骤)。

图 1 22批样品中IgA含量 Figure 1 Content of IgA in 22 samples

表 5 22批样品信息及测定结果 Table 5 The batch numbers and the determination results of 22 samples
3 讨论

目前市场上有很多种人IgA含量检测试剂盒，根据其说明书主要适用于人血清、血浆、尿液和脑脊液等液体中IgA含量的测定，该类试剂盒是否适用于人免疫球蛋白类制品中IgA含量的测定尚未见相关报道。因此，要保证测定结果的准确性，首先必须选择合适的试剂盒。在建立本法的初期，我们对包括ZMC厂家在内的国内外3种试剂盒进行了比较和筛选，发现其中一个试剂盒线性较差，样品稀释液本底高，且复孔间的重复性差；另一个试剂盒受样品基质影响较严重；而ZMC厂家的试剂盒较适用于本法测定(本文未显示相关结果)。为降低检测成本和考虑试剂盒长期供应性的问题，建议其他实验室也可以考虑筛选出性能相当的试剂盒，考量指标主要从标准曲线的线性、空白背景值的大小、样品的基质效应、专属性、复孔间的精密度等方面来评价。同时鉴于ZMC厂家的试剂盒为研究用试剂盒，其中自带的标准品无明确的量值溯源，因此在建立本法时我们采用了NIBSC来源的国际标准品。国际标准品目前仅标示了效价单位，在使用中可按1 IU相当于14.2 μg将样品测定结果换算成质量单位[14]。本研究的方法学验证结果显示，本法灵敏度高，专属性好，不同处方样品不同浓度水平的平均加标回收率均在80%~120%范围内，重复性及中间精密度RSD均小于10%，试剂盒的批间一致性也较好，能满足ELISA分析方法的基本要求。

通过对全国22家企业的静注人免疫球蛋白(pH 4)样品的IgA含量进行检测发现，大部分企业生产的静注人免疫球蛋白(pH 4)的IgA含量较低(< 10 IU·mL-1)，但是也有少数企业生产的产品中IgA含量超过了国外同类产品的最高限度。分析可能与各企业的生产工艺有关，具有纯化工艺(层析)的企业生产的产品IgA含量相对要低一些。因此，为了控制该类制品中IgA的含量，建议一些生产企业在生产工艺中增加纯化步骤。另外，本研究中系用静注人免疫球蛋白(pH 4)样品作为研究对象，若要将该法应用于其他人免疫球蛋白类制品的IgA含量测定，尚需进行相应的方法学验证。

本研究建立的人免疫球蛋白类制品中IgA含量ELISA检测方法灵敏度高，专属性强，线性范围宽，操作简单，适合大量样品的批量分析，不仅满足了对人免疫球蛋白类制品质量控制的需要，也为更好地区分不同工艺生产的产品差异，以便提高产品质量奠定了基础。

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