甲型肝炎病毒经粪-口途径传播，是急性肝炎的常见病原体，而且易发生爆发或流行，引起严重的公共卫生问题^[1-4]。人免疫球蛋白是从健康人血浆中提取制备的一种血液制品，可以用于甲型肝炎流行时的被动免疫预防^[5]。伴随着社会发展和卫生条件的改善，甲型肝炎的自然感染率会有一定程度的下降，导致用于提取人免疫球蛋白的血浆中甲肝抗体水平降低，从而影响人免疫球蛋白的甲肝抗体效价^[6]。

为了保证人免疫球蛋白对甲型肝炎的预防效果，2015年版中国药典新增了对甲肝抗体效价的要求，要求使用酶免法检测效价不低于100 IU·mL^-1[7]。由于我国尚无人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国家标准品，本实验室联合2家单位研制了人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国家标准品，便于生产企业和质量检定部门进行人免疫球蛋白的质量控制，保证了新版药典的实施和药品的质量可控。

1 材料与方法 1.1 待标人免疫球蛋白国家标准品的生产制备

委托广东丹霞生物制药有限公司制备人免疫球蛋白原料，按照2010年版中国药典要求检验合格后，委托武汉生物制品研究所以每支0.5 mL进行分装，冻干封口保存。

1.2 试剂和仪器

第二代人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国际标准品(97/646)，购自NIBSC；anti-HAV ELISA试剂盒购自Mediagnost公司；酶标仪Wellcan MK2为Denley Dragon公司产品。

1.3 分装误差测定

随机抽取分装后冻干前的10支标准品称重，计算分装误差。

1.4 水分含量测定

随机抽取3支冻干后的标准品，按2015年版中国药典水分测定法(通则0832)要求，按照费休氏法测定水分。

1.5 无菌检查

随机抽取6支冻干后的标准品，按2015年版中国药典无菌检查法(通则1101)的薄膜过滤法进行无菌检查。

1.6 甲型肝炎抗体效价测定

将国际标准品(97/646)按标示量复溶后稀释至10、20、30、40、50 mIU·mL^-1作为工作标准，将待标品用1 mL注射用水复溶后稀释2 000倍、3 000倍和4 000倍备用。取准备好的工作标准和待标品100 μL加入已包被甲肝抗原的酶标板孔中(做双孔平行)，密封后37 ℃孵育2 h，加入50 μL抗甲肝IgG标记的过氧化物酶，密封后37 ℃孵育1h，洗板5次，加入100 μL底物室温避光反应30 min，加入100 μL终止液终止反应，450 nm测吸光度。以标准浓度对数值为X值，以吸光度对数值为Y值作双对数直线回归，求得回归方程后，将待标品吸光度代入方程中求加样浓度，根据稀释倍数算出样品浓度。

1.7 加速稳定性试验

取标准品分别于4、25、37 ℃放置158 d，取样进行效价测定。

1.8 长期稳定性试验

取标准品放置于-20 ℃，分别于3、6、12个月取样进行效价和水分测定，之后每半年进行一次效价和水分测定。

2 结果 2.1 标准品质量检测结果

人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国家标准品制备分装后，检测分装精度为0.36%，冻干后成品水分含量为1.4%，无菌检查合格，符合2015年版中国药典三部中对标准物质制备的规定。

2.2 协作标定结果

协作标定由3家单位独立参与完成，分别为成都蓉生药业有限责任公司、武汉生物制品研究所有限责任公司、中国食品药品检定研究院。每个协作标定实验室以人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国际标准品(97/646)为工作标准品，对国家标准品检测7次以上，共测得22次结果，实验室内RSD为实验室A：3.2%(n=8)、实验室B：6.1%(n=7)、实验室C：8.8%(n=7)，实验室间RSD为8.2%。甲肝抗体效价的加权平均值为每支34.5 IU，95%可信区间为每支31.5~37.5 IU。结果见表 1。

2.3 稳定性检测结果

加速破坏稳定性试验：取人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国家标准品于4、25、37 ℃放置158 d，效价测定结果显示各组效价均未下降。结果见表 2。

长期稳定性考察：将标准品于-20 ℃放置3个月、6个月、12个月后取样进行效价测定以及水分含量测定，结果未见效价下降趋势，水分含量无增高趋势。结果见表 3。

3 讨论

人免疫球蛋白的一个主要用途就是用于预防甲型肝炎，欧洲药典规定如果人免疫球蛋白用于预防甲型肝炎，甲型肝炎抗体效价需不低于100 IU·mL^-1[8]。2015年版之前的中国药典并未对人免疫球蛋白产品中的甲型肝炎抗体效价进行明确规定，为了保证人免疫球蛋白对甲型肝炎的预防效果，2015年版中国药典新增了对人免疫球蛋白产品甲肝抗体效价的要求。为配合新版药典实施，本实验室及时研制了人免疫球蛋白甲型肝炎抗体国家标准品，为该产品的质量控制提供了标准。

酶联免疫技术由于其高特异性和高灵敏度，被广泛应用于病毒抗原抗体的检测^[9-15]，中国药典也规定采用酶免法检测人免疫球蛋白中的甲型肝炎抗体。为了提高检测的准确性，本实验室采用加样时设定平行孔以及设置不同样品稀释度求平均值的方法。

本标准品于4、25、37 ℃放置158 d以及在-20 ℃放置3、6、12个月后检测效价，均未见下降趋势，说明该标准品的稳定性较好，长期稳定性仍在继续考察中。该标准品已获得国家生物制品标准物质委员会批准，批准文号为(2016)国生标字0033。