2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 重庆巴南区人民医院, 重庆 401320;
3. 重庆医科大学药学院, 重庆 400016
2. Banan People's Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing 401320, China;
3. School of Pharmacy, Chongqing Medical University, Chongqing 400016, China
木犀草素（luteolin，分子式C15H10O6）是一种天然的弱酸性四羟基黄酮化合物，广泛存在于金银花、筋骨草、荆芥、芽甘蓝、甜椒、落花生等天然植物中[1]。近年来研究证实，木犀草素是一种拓扑异构酶抑制剂，可在多靶点、多途径、多环节产生抗肿瘤作用，是一种很有前景的抗肿瘤药物[2-3]。木犀草素还具有抗氧化、抗炎、抗菌等方面的作用[4]。然而木犀草素水溶性较差[5-6]，限制了其临床应用。磺丁基醚-β-环糊精（sulfobutyl ether-β-cyclodextrin，SBE-β-CD）具有毒性小、增溶作用大、包合能力强等优点[7-8]，将木犀草素制成SBE-β-CD包合物[9]，可以增加药物的溶解性和稳定性，提高药物生物利用度。本文采用HPLC法[10-11]考察木犀草素及其SBE-β-CD包合物在大鼠体内药代动力学特征[12]，可为木犀草素新剂型的研发提供新思路，为新一代抗癌药物的研发提供参考依据。
1 仪器与材料 1.1 仪器岛津SPD-20A高效液相色谱仪（岛津公司）；Discovery DV215CD型电子分析天平（OHAUS公司）；G16型医用离心机（北京白洋医疗器械公司）；HITECH Edi-S10UV实验室纯水系统（上海和泰仪器有限公司）；MD200-1型氮吹仪（杭州奥盛仪器有限公司）。ODS色谱柱（型号：ZORBAX SB-C18；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；规格：4.6 mm×250 mm，5 μm；生产厂家：Agilent公司）。
1.2 试药木犀草素对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-14050411，纯度大于98%）；香叶木素对照品（成都曼思特生物科技有限公司，批号MUST-14122404，纯度大于98%）；木犀草素（西安唯奥生物科技有限公司，批号20140912，纯度98%）；木犀草素/SBE-β-CD包合物（自制，批号20150629）；SBE-β-CD（山东滨州智源生物科技有限公司，批号20140626，平均取代度6.5，相对分子质量2 162）；CMC-Na（国药集团化学试剂有限公司）；肝素钠注射液（天津生物化学制药有限公司）；甲醇（TEDIA公司，色谱纯）；磷酸、乙酸乙酯、三氯乙酸、浓盐酸均为分析纯；实验用水为超纯水。
1.3 受试动物SD大鼠24只，（200±10）g，雌雄各半，清洁级，由重庆医科大学实验动物中心提供，合格证号SYXK（渝）2012-0001。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.2%磷酸-甲醇溶液（48:52）；检测波长：348 nm；流速：1.0 mL·min-1；柱温：25 ℃；进样量：10 μL。
2.2 溶液配制10 mol·L-1盐酸溶液：量取浓盐酸（12 mol·L-1）8.4 mL于10 mL量瓶中，纯化水稀释至刻度，即得浓度为10 mol·L-1的盐酸溶液。
10%三氯乙酸溶液：称取三氯乙酸1.01 g于10 mL量瓶中，纯化水溶解并稀释至刻度，即得10%三氯乙酸溶液。
木犀草素对照品储备溶液：精密称取木犀草素对照品0.002 6 g，置10 mL量瓶中，甲醇溶解定容，摇匀，即得质量浓度为0.260 0 mg·mL-1的对照品储备溶液，4 ℃保存，备用。
内标溶液：精密称取内标物质香叶木素对照品0.002 6 g于10 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度。取该溶液1 mL于10 mL量瓶中，甲醇稀释至刻度，即得质量浓度为0.026 0 mg·mL-1的内标溶液，4 ℃保存，备用。
2.3 木犀草素及其SBE-β-CD包合物口服药物和尾静脉注射剂的制备 2.3.1 木犀草素/SBE-β-CD包合物精密称取木犀草素与SBE-β-CD适量，混匀（SBE-β-CD与木犀草素投料比例2:1），缓慢加入纯化水100 μL，沿同一方向研磨70 min，得初步包合物。将包合物于60 ℃干燥1 h，研细，置于垫有滤纸的布氏漏斗中，用适量无水乙醇洗涤未被包合的木犀草素并抽滤，60 ℃干燥20 min，即得木犀草素/SBE-β-CD包合物，测得木犀草素/SBE-β-CD包合物的主客分子比为1:1，平均包合率为75.94%，木犀草素/SBE-β-CD包合物在水中溶解度为5 174.25 mg·L-1（木犀草素在水中溶解度为82.26 mg·L-1），木犀草素/SBE-β-CD包合物的油水分配系数为1.008 4（木犀草素的油水分配系数为0.765 6）。
2.3.2 木犀草素口服药物精密称取木犀草素0.100 3 g于50 mL量瓶中，用0.5%的CMC-Na溶液溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为2.006 mg·mL-1的木犀草素口服制剂。
2.3.3 木犀草素/SBE-β-CD包合物口服制剂精密称取木犀草素/SBE-β-CD包合物（含量12.49%）适量于10 mL量瓶中，用0.5%的CMC-Na溶液溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为2.802 0 mg·mL-1的木犀草素/SBE-β-CD包合物口服制剂。
2.3.4 木犀草素尾静脉注射剂精密称取木犀草素适量于10 mL量瓶中，用0.9%生理盐水溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为0.531 0 mg·mL-1的木犀草素尾静脉注射剂。
2.3.5 木犀草素/SBE-β-CD包合物尾静脉注射剂精密称取木犀草素/SBE-β-CD包合物（含量4.70%）适量于10 mL量瓶中，用0.9%生理盐水溶解并稀释至刻度，得到质量浓度为0.481 0 mg·mL-1的木犀草素/SBE-β-CD包合物尾静脉注射剂。
2.4 血浆样品的处理取大鼠血浆样品100 μL，加入内标溶液（0.026 0 mg·mL-1）10 μL，甲醇10 μL，盐酸溶液（10 mol·L-1）100 μL，80 ℃水浴2 h，冷却后加入三氯乙酸溶液（10%）50 μL混匀，加入乙酸乙酯2 mL萃取，10 000 r·min-1离心10 min，取上层乙酸乙酯1 mL，备用。残液再用乙酸乙酯2 mL进行二次萃取，10 000 r·min-1离心10 min，取上层乙酸乙酯1 mL，合并2次萃取液，于水浴40 ℃氮气吹干，甲醇100 μL复溶后12 000r·min-1离心10 min，待测。
2.5 方法学研究 2.5.1 专属性按照“2.1”项下色谱条件，分别考察大鼠空白血浆、空白加内标加对照品及血浆样品的色谱图，见图 1。
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1.木犀草素（luteolin）2.内标（internal standard） A.木犀草素对照品+内标紫外扫描图谱（the UV absorption spectra of luteolin and internal standard）B.空白血浆（blank plasma）C.空白血浆+木犀草素对照品+内标（blank plasma and luteolin and internal standard）D.血浆样品（plasma sample） 图 1 HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms |
取8份空白鼠血浆，依次加入木犀草素对照品溶液及0.0260 mg·mL-1内标溶液各10μL，分别配制成血药浓度为0.06、0.13、0.26、0.65、1.30、2.60、6.50、13.00μg·mL-1的标准血浆样品，按“2.4”项下方法处理后，进样10 μL，记录木犀草素及内标峰面积，计算木犀草素与内标峰面积比值（R），以R为纵坐标，血浆浓度C为横坐标进行线性回归，得线性回归方程：
R=0.715 1C+0.149 1 r=0.998 1
结果表明：木犀草素血浆质量浓度在0.06~13.00 μg·mL-1范围内，线性关系良好。木犀草素在血浆中的最低定量限为0.06 μg·mL-1（S/N > 10）。
2.5.3 精密度日内精密度：按“2.5.2”项下方法分别配制含木犀草素0.13、1.30、13.00 μg·mL-1的低、中、高3种浓度的标准血浆样品各5份，按“2.4”项下方法处理后，进样10 μL，连续测定5 d，记录木犀草素及内标峰面积。计算木犀草素与内标峰面积比值（R），计算日内精密度RSD分别为13.3%、5.4%、9.2%，日间精密度RSD分别为14.3%、9.0%、7.9%，结果表明，日内精密度及日间精密度均满足含量测定要求。
2.5.4 提取回收率按“2.5.2”项下方法分别配制含木犀草素0.13、1.30、13.00 μg·mL-1的低、中、高3种浓度的标准血浆样品各5份，按“2.4”项下方法处理后，进样10 μL，将所得峰面积与相同浓度未经提取的木犀草素对照品溶液直接进样所得的峰面积相比，得提取回收率分别为72.2%、78.2%、86.6%，RSD分别为12.8%、8.4%、5.6%，同法可得内标提取回收率分别为70.2%、72.2%、75.3%，RSD分别为12.0%、8.1%、4.7%。结果表明，木犀草素对照品及内标通过该方法处理后提取回收率良好。
2.5.5 稳定性室温放置稳定性：按“2.5.2”项下方法分别配制含木犀草素0.13、1.30、13.00 μg·mL-1的低、中、高3种浓度的标准血浆样品各6份，按“2.4”项下方法处理后，分别于0、2、4、8、16、24 h进样10 μL，记录木犀草素及内标峰面积，计算可得木犀草素低、中、高浓度的血浆对照品峰面积的RSD分别为10.0%、7.8%、11.0%。结果表明，木犀草素标准血浆样品在24 h内稳定。
反复冻融稳定性：按“2.5.2”项下方法分别配制含木犀草素0.13、1.30、13.00 μg·mL-1的低、中、高3种浓度的标准血浆样品各6份，于-20 ℃冷冻后，在室温下放置完全融解，按“2.4”项下方法处理后进样10 μL，记录木犀草素及内标峰面积。将剩余样品复置于-20 ℃冷冻，然后再取出融解后分析，反复冻融3次，进而考察样品的反复冻融稳定性。计算可得木犀草素低、中、高浓度的血浆对照品峰面积的RSD分别为9.1%、8.7%、9.3%。结果表明，血浆木犀草素标准样品反复冻融3次稳定。
2.6 药代动力学研究 2.6.1 灌胃方式给药取SD大鼠12只，随机分为木犀草素组和木犀草素/SBE-β-CD包合物组，每组6只，禁食12 h后灌胃给药，剂量为30 mg·kg-1。分别于给药前，给药后5、15、30、45、60 min及2、4、6、8、10、12、24 h采血，置于肝素化EP管中，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液血浆，于-20 ℃保存，备用。取血浆样品，按“2.4”项下处理后进样10μL，计算木犀草素及内标峰面积比值R。
2.6.2 尾静脉注射给药取SD大鼠12只，随机分为木犀草素组和木犀草素/SBE-β-CD包合物组，每组6只，禁食12 h后尾静脉注射给药，剂量为2.4mg·kg-1。分别于给药前，给药后5、15、30、45、60 min及2、4、6、8、10、12、24 h采血，置于肝素化EP管中，3 000 r·min-1离心10 min，吸取上清液血浆，于-20 ℃保存，备用。取血浆样品，按“2.4”项下方法处理后进样10 μL，计算木犀草素及内标的峰面积比值R。
2.6.3 血药浓度-时间曲线计算各时间点血药浓度，绘制血药浓度-时间曲线。经DAS药动学软件包自动拟合数据，计算相关药代动力学参数，见表 1。血药浓度-时间曲线见图 2。
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表 1 木犀草素及其SBE-β-CD包合物的药动学参数（n=6） Table 1 Main pharmacokinetic parameters of luteolin and its SBE-β-CD inclusion complex |
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1.木犀草素（lateolin）2. SBE-β-CD包合物（SBE-β-CD inclusion complex） A.灌胃（ig）B.静注（iv） 图 2 木犀草素平均血药浓度-时间曲线 Figure 2 Mean plasma concentration-time curves of luteolin |
结果表明，大鼠分别在经灌胃和尾静脉注射给予木犀草素与木犀草素/SBE-β-CD包合物后，木犀草素/SBE-β-CD包合物组的达峰时间提前，峰浓度与药-时曲线下面积增大，生物利用度提高。
3 讨论目前，木犀草素包合物的制备方法有饱和水溶液法、冷冻干燥法、研磨法等[13]。本文采用研磨法制备木犀草素/SBE-β-CD包合物，采用单周期单剂量的给药方案测定木犀草素及木犀草素/SBE-β-CD包合物的血药浓度，考察其在大鼠体内的药代动力学特征[14]，结果显示木犀草素/SBE-β-CD包合物组达峰时间提前，峰浓度与药-时曲线下面积增大，SBE-β-CD对木犀草素的包合作用使生物利用度提高。一方面因木犀草素/SBE-β-CD包合物的溶解度增加，促进了木犀草素透过黏液层和不流动水层，使其与细胞膜接触面增大；另一方面木犀草素/SBE-β-CD包合物油水分配系数增大[15-16]，推测SBE-β-CD为维持包合物-非包合络合物的共存平衡，在水-生物相的界面发挥传递作用，使木犀草素透过生物膜的量增大，从而使生物利用度提高[17]。
香叶木素是木犀草素半合成过程中的中间产物，与木犀草素结构类似[18]，提取回收率稳定，且在本实验条件下与木犀草素相互无干扰，故选择香叶木素为内标物质，以避免前处理过程及进样体积的误差对测定的影响。
研究表明[19]，木犀草素主要靠疏水作用力与人血清白蛋白（HSA）的色氨酸结合，结合作用较强，水解方法主要有β-葡糖醛酸苷酶水解和酸水解[20]。本实验采用10 mol·L-1盐酸溶液水解蛋白，10%三氯乙酸溶液沉淀蛋白，乙酸乙酯提取木犀草素[21]，可使木犀草素最大程度从与血浆蛋白的结合中释放出来。
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