2018, Vol. 38 
2. 北京中医药大学, 北京 100102
2. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100102, China
何首乌为蓼科植物何首乌的块根；其味苦，甘，涩，性微温，归肝、肾经，是临床常用的补益药，临床应用有生何首乌与制何首乌之分。生首乌具解毒、消痈、截疟、润肠通便之功效；制首乌可补肝肾、益精血、乌须发、强筋骨。近年来有关何首乌及其制剂临床不良反应报道逐渐增多，尤其是何首乌导致的肝损伤问题[1-5]。但目前关于何首乌导致肝损伤的成分不明确，报道的研究中也存在诸多矛盾，何首乌及何首乌中化学成分导致肝损伤机制的研究不全面。何首乌化学成分主要含蒽醌类（anthraquinones）化合物，蒽醌类化合物按母核的结构分为单蒽核类及双蒽核类两大类。蒽醌类化合物包括了其不同还原程度的产物和二聚物，如蒽酚、氧化蒽酚、蒽酮、二蒽醌、二蒽酮等，另外还有这些化合物的苷类。徐文[6]首次从何首乌中发现大量二蒽酮类成分，并鉴定出28个新的蒽酮二聚体糖苷成分（二蒽酮苷），其运用高分辨质谱技术证实了何首乌中二蒽酮糖苷成分为大黄素（10→10′）大黄素或大黄素（10→10′）大黄素甲醚的母核。有研究表明[7]，大黄素在体内特定条件下有可能生物转化为一系列蒽酮及蒽酮糖苷类化合物。前期研究结果[8-9]表明，何首乌中含量较高的大黄素、大黄素甲醚具有潜在肝毒性，因此本实验以何首乌中另一类成分蒽酮为研究对象，旨在阐明何首乌中化学成分的肝毒性物质基础，发现各化合物间的内在联系及是否存在毒性与结构间的构效关系。
尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶（uridine 5′-diphosphate glucuronosyltransferases，UGTs）是人体中最重要的二相代谢酶，能催化具有羟基、巯基、胺基、羧基和稀醇基团的脂溶性药物或内源性物质与尿苷-5′-二磷酸葡萄糖酸酸的结合，使其水溶性增加，从而随尿与胆汁排出，防止内源和外源性物质在体内蓄积产生毒性[10-11]。UDP-葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1酶）是人体UGTs家族中非常重要的一员，能代谢内源性物质胆红素和炔雌醇等。胆红素是人体内一种非常重要的内源性物质，是临床上判定黄疸的重要依据，也是肝功能的重要指标和肝损害的重要生物标志物。胆红素在体内主要由UGT1A1酶转化为水溶性胆红素葡萄糖醛酸结合物（单葡萄糖醛酸胆红素BMG1、BMG2，双葡萄糖醛酸胆红素BDG），从肝细胞分泌至胆汁中消除[12-13]。若UGT1A1酶受到外源性药物抑制，非结合型胆红素（UCB）无法转化为结合型胆红素（BG）或转化减少，胆红素代谢则出现障碍，继而导致UCB在肝细胞和血液内蓄积，引发毒性。因此考察药物对UGT1A1介导的胆红素葡萄糖醛酸结合的影响将有助于预测该药物对肝脏是否具有毒性及毒性大小。本文在前期实验基础上，采用体外大鼠肝微粒体温孵体系，对待测成分进行毒性评价。
1 仪器与试药 1.1 实验仪器Waters AcquityTM Ultra Performance LC超高效液相色谱仪（Waters公司），Waters XevoTM Q-TOF/MS质谱系统（Waters公司）；METTLER TOLEDO AE240型电子天平（梅特勒-托利多公司）；SDC-6节能型职能恒温槽（宁波新芝生物科技股份有限公司）；Thermo 17R型高速低温离心机（Thermo公司）。分析柱：Acquity UPLC HSS C18（十八烷基硅烷键合硅胶；2.1 mm×100 mm，1.8 μm；沃特世科技）；预柱：Acquity UPLC HSS C18 VanGuard Pre-column（十八烷基硅烷键合硅胶；2.1 mm×5 mm，1.8 μm；沃特世科技）。
1.2 材料与试剂大鼠肝微粒体（rat liver microsomes，RLM）购自BD Gentest公司；磷酸钾（纯度≥98%）、氯化镁（纯度≥98%）、抗坏血酸（纯度≥98%）、三羟甲基氨基甲烷（Tris，纯度≥98%）均购自百灵威科技；葡萄糖二酸单内酯（纯度≥98%）、丙甲菌素（纯度≥98%）、尿苷二磷酸葡萄糖醛酸（UDPGA，纯度≥98%）、二甲基亚砜（DMSO，纯度≥98%）均购自Sigma Aldrich公司；胆红素（批号100077-201206，含量99.3%）来自中国食品药品检定研究院。
游离二蒽酮（反式-大黄素-大黄素二蒽酮，顺式-大黄素-大黄素二蒽酮）及单糖二蒽酮（polygonumnolides C2-C4）均为杨建波博士（中国医学科学院药物研究所，博士课题提取分离单体）赠予。甲酸、盐酸均为分析纯，乙腈、甲醇均为色谱纯。
2 方法与结果 2.1 色谱条件[14]分析柱：Acquity UPLC HSS C18（2.1 mm×100 mm，1.8 μm）；预柱：Acquity UPLC HSS C18 VanGuard Pre-column（2.1 mm×5 mm，1.8 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~2.1 min，40%A→75%A；2.1~4.2 min，75%A→95%A；4.2~8.0 min，95%A；8.0~8.5 min，95%A→40%A；8.5~12.5 min，40%A）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：35 ℃；检测波长：450 nm；进样量：10 μL。
2.2 UDPGA-发生系统的制备[14]精密称取氯化镁、葡糖二酸单内酯、丙甲菌素、UDPGA适量，用Tris-HCl缓冲液（称取Tris 121.1 g，加入去离子水800 mL，加浓盐酸调pH至7.4，以去离子水定容至1 000 mL）使溶解，使含氯化镁5 mmol·L-1，葡糖二酸单内酯5 mmol·L-1，丙甲菌素25 μg·mL-1，UDPGA 5mmol·L-1，即得UDPGA-发生系统。
2.3 溶液的制备 2.3.1 对照品溶液分别精密称取胆红素、反式-大黄素-大黄素二蒽酮、顺式-大黄素-大黄素二蒽酮、polygonumnolides C2-C4的对照品适量，加DMSO溶解制成系列浓度溶液（胆红素0.12~1.37 μmol·L-1，反式-大黄素-大黄素二蒽酮0.018~0.29 μmol·L-1，顺式-大黄素-大黄素二蒽酮0.015~0.25 μmol·L-1，polygonumnolide C2 0.08~1.3 μmol·L-1，polygonumnolide C3 0.15~2.5 μmol·L-1，polygonumnolide C4 0.016~0.26 μmol·L-1）。
2.3.2 供试品溶液[15-19]取蛋白浓度为0.5 mg·L-1的RLM 30 μL放至室温，复融后，加入“2.3.1”项中系列浓度的底物胆红素对照品溶液及待测单体对照品溶液各1 μL，置37 ℃恒温水浴预孵育3 min后，加入新鲜配制的UDPGA-发生系统溶液68 μL启动反应。反应10 min后立即加入冰乙腈-甲醇（2:1，含抗坏血酸浓度为200 μmol·L-1）600 μL终止反应，沉淀蛋白，涡旋1 min，于13 000 r·min-1（r=5 cm）离心25 min，取上清液即得[体系终体积为200 μL，DMSO总用量不超过1%（v/v）]。
2.4 方法学考察 2.4.1 日内、日间精密度考察按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，仅加入底物胆红素，使含胆红素浓度为0.5、5、50 μmol·L-1，按上述色谱条件测定胆红素高、中、低3个浓度下底物胆红素及代谢产物，每个浓度平行5份（n=5），日内及日间（连续5 d）进样测定。RSD均小于5%，结果符合生物样品测定要求[20]。
2.4.2 回收率考察按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，仅加入底物胆红素，使含胆红素浓度为0.5、5、50 μmol·L-1，按上述色谱条件测定胆红素高、中、低3个浓度下回收率，每个浓度平行5份（n=5），回收率87%~115%，结果符合生物样品测定要求[20]。
2.4.3 标准曲线按“2.3.2”项方法制备供试品溶液，仅加入底物胆红素，按上述液相色谱条件测定胆红素RLM体系中标准曲线。胆红素线性范围为5.65×10-7~8.92×10-6 mol，回归方程：
Y=2.59×105X-2 316.1 R2=0.984
2.5 蒽酮及蒽酮糖苷成分对UGT1A1酶的抑制考察本实验选取的待测单体为何首乌中二蒽酮及二蒽酮单糖苷5个单体化合物，结构见图 1。按“2.3”项所述方法，分别以胆红素的总代谢产物生成量对胆红素底物浓度作图，以米氏方程双倒数法作图法测定，横坐标为底物胆红素浓度的倒数（1/S），纵坐标为加入待测单体后胆红素代谢反应速率的倒数（1/V）；加入不同浓度待测单体对应不同曲线，以不同曲线的斜率对应胆红素底物浓度绘制slop图，求得抑制常数Ki；5个单体在RLM中对UGT1A1酶的动力学参数的影响，及对UGT1A1酶的抑制情况图 2及表 1。
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图 1 二蒽酮及二蒽酮单糖苷结构图 Figure 1 The structures of dianthenone and dianthenone glycoside |
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a1-e1.加入待测单体后UGT1A1酶双倒数方程（the lineweaver-burk plot of UGT1A1 enzyme after adding emodin） a2-e2加入待测单体后slop图（the slop plot of UGT1A1 enzyme after adding emodin） a. polygonumnolide C2 b. polygonumnolide C3 c. polygonumnolide C4 d.反式-大黄素-大黄素二蒽酮（trans-emodin dianthrone）e.顺式-大黄素-大黄素二蒽酮（cis-emodin dianthrone） 图 2 RLM体系中待测单体对UGT1A1酶动力学参数的影响 Figure 2 The impact on UGT1A1 enzyme kinetic parameter after adding different test monomer in RLM |
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表 1 RLM体系中待测单体对UGT1A1酶的影响（X±SD，n=3） Table 1 The impact on UGT1A1 enzyme kinetic parameter after adding different test monomer in RLM |
实验数据采用SPSS Statistics 17.0统计软件进行单因素方差分析（One-Way ANOVA），结果发现：5种待测单体成分在RLM体系中对UGT1A1酶的抑制情况由强至弱的顺序为：顺式-大黄素-大黄素二蒽酮（强抑制），反式-大黄素-大黄素二蒽酮（强抑制），polygonumnolide C2（强抑制），polygonumnolide C3（中等强度抑制），polygonumnolide C4（弱抑制）。提示：待测单体除polygonumnolide C4外，均具有潜在肝毒性，且二蒽酮抑制率均高于蒽酮糖苷。
3 讨论实验结果表明，何首乌中二蒽酮及蒽酮糖苷类成分可抑制UGT1A1酶活性，推测该抑制作用为其肝毒性作用机制。
分析5种化合物结构发现，二蒽酮类化合物：反式-大黄素-大黄素二蒽酮和顺式-大黄素-大黄素二蒽酮均可由两分子大黄素通过酶催化反应生物合成。前期研究结果表明，何首乌中大黄素型蒽醌类化合物可选择性抑制UGT1A1酶[9]，且存在构效关系，大黄素型蒽醌母核上的6-OH为其药效团，影响抑制强弱。本实验选取的二蒽酮包含2个6-OH药效团，推测因此表现出更强的抑制作用。同时，反式-大黄素-大黄素二蒽酮和顺式-大黄素-大黄素二蒽酮均存在不同的空间构型，C10和C10′的相对位置影响6（6′）-OH的立体环境。如图 3（采用Chem3D Ultra软件绘制结构图，且使得化学键能量最小化）所示：反式-大黄素-大黄素二蒽酮（A：αH-10/βH-10′；B：βH-10/ αH-10′），2个羟基位于分子的同一侧，空间存在一定位阻；而顺式-大黄素-大黄素二蒽酮（C：αH-10/αH-10′；D：βH-10/βH-10′），2个羟基完全裸露，更有利于与UGT1A1酶结合。因此顺式构型表现出了更强的抑制作用。分析二蒽酮葡萄糖苷类成分的抑制情况发现：如图 4（采用Chem3D Ultra软件绘制结构图，且使得化学键能量最小化）所示，将葡萄糖单元引入母核，增加了6（6′）-羟基的空间位阻，其不利于与UGT1A1的结合，导致不同程度的活性降低。其中C4（αH-10 /βH-10′）具有最大的空间位阻，其抑制作用消失。
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A.反式-大黄素-大黄素二蒽酮（αH-10/βH-10′）（trans-emodin dianthrone（αH-10/βH-10′））B.反式-大黄素-大黄素二蒽酮（βH-10/ αH-10′）（trans-emodin dianthrone（βH-10/ αH-10′））C.顺式-大黄素-大黄素二蒽酮（αH-10/αH-10′）（cis-emodin dianthrone（αH-10/αH-10′））D.顺式-大黄素-大黄素二蒽酮（αH-10/αH-10′）（cis-emodin dianthrone（βH-10/βH-10′）） 图 3 二蒽酮立体结构图 Figure 3 Chem3D structures of trans-and cis-emodin dianthrones |
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图 4 二蒽酮糖苷C2（A）、C3（B）、C4（C）立体结构图 Figure 4 Chem3D structures of Polygonumnoides C2(A), C3(B)and C4 (C) |
本实验设计以胆红素代谢过程中UGT1A1酶介导的胆红素葡萄糖醛酸结合环节为切入点，从代谢酶角度考察何首乌化学成分致肝毒性药物的毒性机制。目前国外关于药物对胆红素代谢产生影响主要集中一些具有特殊结构的成分，如黄酮、蒽醌、多酚、生物碱，推测其为UGT1A1酶的潜在底物或抑制剂，可影响其介导的胆红素结合环节。化学研究表明，何首乌主要成分为蒽醌类、黄酮类、酚酸类、二苯乙烯类以及磷脂类等成分，本实验研究以何首乌中一类重要成分蒽醌为研究对象，旨在从化学结构角度分析阐明其潜在肝毒性的作用机制，为中药肝毒性药物的筛选提供新思路和新方法，对中药安全性评价具有借鉴意义。
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