2018, Vol. 38 
缬草醛类（baldrinals）成分为缬草属（Valeriana Linn.）植物中缬草素类（valepotriates）成分经加热回流降解产生的一系列降解成分。2010年版中国药典曾将缬草素和乙酰缬草素作为蜘蛛香的含量测定指标[1]，但因其稳定性差，衍生出一系列质量控制难题，2015年版中国药典又将蜘蛛香含量测定指标取消。研究发现，蜘蛛香在乙醇高温回流下会产生大量的缬草素类降解产物缬草醛类成分，而缬草醛类成分能够稳定存在，并在治疗肠易激综合征（irritable bowel syndrome）方面有较好的药理活性，国外一些研究发现其在镇静方面的药理作用也比较明显[2-3]。课题组前期研究发现，经过大孔树脂富集后的缬草醛类成分对正常小鼠的胃肠运动有一定的抑制作用，可缓解利血平化小鼠的胃肠功能亢进，也可降低慢性应激所致模型大鼠的内脏敏感性，可显著减少模型大鼠的排便量，同时对动物的精神活动有一定的改善作用及明显的镇痛作用[4-7]。其中缬草醛类成分11-乙氧基缬草醛对肠易激综合征模型大鼠有较好的治疗作用，还具有明显的止泻作用，提示这可能是改善腹泻型肠易激综合征的有效物质基础[8-9]。由于该类成分具有较强的药理活性，有望成为将来控制蜘蛛香含量测定的指标成分。近年来高分辨质谱已成为复杂中药化学成分快速表征的主要技术之一[10-19]，研究已知中药化合物的多级质谱裂解规律，总结其特征碎片是质谱进行中药化合物快速鉴定和复杂体系成分表征的前提之一。王春国等[20-21]报道了6个缬草素成分的电喷雾质谱裂解规律，建立了区分单烯型、双烯型和四烯型缬草素的质谱方法，但是对缬草素类成分降解产物缬草醛类成分的快速区分和鉴定方法尚未见报道。
LTQ-Orbitrap MS是将线性离子阱质谱和高分辨质谱结合的杂交型质谱仪，同时具有离子阱质谱的多级碎裂和Orbitrap的高质量分辨能力和精确质量数的优势。本实验通过UPLC-LTQ-Orbitrap MS高分辨多级质谱技术对4个缬草醛类成分（其结构见图 1）在电喷雾离子源质谱下的裂解机制和结构之间的关系进行系统研究，为快速鉴定该类化合物提供一种新方法。
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图 1 结构式 Figure 1 Chemical structures |
LTQ-Oribitrap XL线性离子阱-串联静电场轨道阱质谱仪（美国Thermo Scientific公司产品，配有电喷雾离子源（HESI）、Xcalibur 2.1化学工作站）；Thermo Scientific Dionex Utimate 3000 UHPLC Plus Focused超高液相色谱系统（美国Thermo Scientific公司含二元梯度泵，自动进样器，柱温箱，DAD检测器；Chromeleon 7工作站）；Millipore Synergy UV型超纯水机（美国Millipore公司）；R200D型电子分析天平（十万分之一，德国Sartorius公司）。
1.2 试药对照品缬草醛、11-乙酰基缬草醛、11-甲氧基缬草醛和去酰基缬草醛（本实验室自制，HPLC峰面积归一化法计算纯度 > 99%）；乙腈（色谱纯，美国Fisher公司）；水为双蒸水并经0.45 μm滤膜滤过。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱：UPLC BEH-C18柱（1.7 µm，2.1 mm×100 mm，Waters，Ireland）；流动相：0.1%甲酸水溶液（A）-乙腈（B），洗脱条件（0~20 min，85%A→50%A）；20~25 min，50%A→20%A；25~30 min，20%A）；流速：0.3 mL·min-1；柱温：30 ℃；检测波长：288 nm；进样量：2 μL。
2.2 质谱条件电喷雾离子源，正离子检出模式，离子源温度350 ℃，电离源电压4 kV，毛细管电压25 V，管透镜电压110 V，鞘气和辅助气均为高纯氮气（纯度 > 99.99%），鞘气流速30 arb，辅助气流速10 arb；数据采用傅里叶变换高分辨全扫方式数据依赖性ddMS3采集方法。
2.3 供试品溶液制备蜘蛛香原药材32.50 kg，用12倍量70%乙醇加热回流提取2次，每次3 h，过滤，合并滤液，减压浓缩，进行大孔树脂富集得大孔树脂洗脱物的干膏330.00 g。得到的干膏经反复硅胶柱层析以及羟丙基葡聚糖凝胶柱层析分离纯化，在石油醚-乙酸乙酯（9:1）洗脱部位分离纯化得到11-乙氧基缬草醛约50 mg；在石油醚-乙酸乙酯（8:2）洗脱部位分离纯化得到缬草醛约10 mg；在石油醚-乙酸乙酯（4:2）洗脱部位分离纯化得到11-甲氧基缬草醛约10 mg；在石油醚-乙酸乙酯（1:1）洗脱部位分离纯化得到去酰基缬草醛约10 mg。将缬草醛、11-乙酰基缬草醛、11-甲氧基缬草醛和去酰基缬草醛各精密称取1 mg，置于25 mL量瓶中，甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，经0.45 μm滤膜滤过，即得供试品溶液，通过自动进样器进样2 μL进行分析。
2.4 11-乙氧基缬草醛的电喷雾质谱研究在电喷雾离子源正离子模式下，11-乙氧基缬草醛出现[M+H]+峰，m/z 205.085 6（C12H13O3）。LTQ-Orbitrap多级质谱分析，MS2中呈现m/z 177.054 2（C10H9O3，2%），m/z 160.893 7（C10H9O2，100%），m/z 148.878 9（C9H9O2，3%），m/z 132.901 7（C9H9O，8%），m/z 104.850 7（C8H8，5%）等碎片离子。11-乙氧基缬草醛母核为四烯型的环戊烷骈吡喃结构，并与C-10位的醛基形成大的共轭π键，使C-11位活泼氢离域并进攻相连接的醚键，使之发生断裂形成丰度极高的m/z 160.893 7碎片离子。选择母离子m/z 160.8937（C10H9O2，100%）进行碰撞诱导裂解（CID），在三级质谱中出现m/z 132.880 0（C9H9O，100%）、m/z 104.847 6（C8H8，84.5%）、m/z 78.883 5（C6H7，3%）等碎片离子。其中特征碎片离子m/z 132.880 0形成有2种碎裂途径：一是C-8位醛基结构碎裂丢失一分子CO形成；二是吡喃环母核结构中环氧结构发生跨环断裂丢失一分子CO形成。碎片离子m/z 132.880 0丢失CO形成m/z 104.847 6，发生跨环裂解形成m/z 78.883 5碎片离子。其质谱图及裂解行为见图 2、3。
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图 2 11-乙氧基缬草醛的2级（A）和3级（B）质谱图 Figure 2 The MS2 (A) and MS3 (B) spectra of 11-ethoxyviburtinal |
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图 3 11-乙氧基缬草醛的质谱裂解途径 Figure 3 MS fragment pathways of 11-ethoxyviburtinal under positive mode |
在电喷雾离子源正离子模式下，11-甲氧基缬草醛出现[M+H]+峰，m/z 191.069 8（C11H11O3）。11-甲氧基缬草醛与“2.4”项所述11-乙氧基缬草醛仅是C-11位甲氧基和乙氧基的区别，其质谱裂解行为与11-乙氧基缬草醛基本一致。其中MS2中呈现的m/z 130.868 4（C9H7O，61%）与MS3中呈现的m/z 132.943 9（C9H9O，100%）分别是由11-甲氧基缬草醛2种截然不同的裂解途径形成的，“2.4”项已经说明C-8位醛基结构碎裂和吡喃环母核结构中环氧结构发生跨环断裂都会形成m/z 132.943 9。而m/z 130.868 42碎片离子的形成则是由碎片离子m/z 177.054 2中γ氢发生重排反应后m/z 148.878 9进一步丢失一分子H2O形成的。其质谱图及裂解行为见图 4、5。
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图 4 11-甲氧基缬草醛的2级（A）和3级（B）质谱图 Figure 4 The MS2 (A) and MS3 (B) spectra of 11-methoxyviburtinal |
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图 5 11-甲氧基缬草醛的质谱裂解途径 Figure 5 MS fragment pathways of 11-methoxyviburtinal under positive mode |
在电喷雾离子源正离子模式下，去酰基缬草醛出现[M+H]+峰，m/z 177.054 2（C10H9O3）。去酰基缬草醛与“2.4”、“2.5”项所述11-乙氧基缬草醛和11-甲氧基缬草醛仅是C-11位醚键与醇羟基的区别，其质谱裂解行为与11-乙氧基缬草醛、11-甲氧基缬草醛基本一致。但是去酰基缬草醛未出现m/z 133的碎片离子，而仅出现m/z 130.860 7（C9H7O，100%）的碎片离子（如图 6），说明醇羟基的引入使去酰基缬草醛发生了新的裂解机制。醇羟基正好处于吡喃环母核双键的γ位置，γ位活泼氢往往会发生重排反应产生特征碎片离子[如图 7 m/z 149（A）和m/z 131（A）]。m/z 131也有可能来源于C-8位丢失CO[m/z 149（B）]后脱H2O形成[m/z 131（B）]，但是在MS3碎裂后产生丰度最高的m/z 102.882 9（C8H7，100%）的碎片离子，只能由m/z 131（A）脱去H2O后形成。所以去酰基缬草醛γ位活泼氢重排反应是其裂解新机制，并占主导地位。其质谱图和裂解行为见图 6、7。
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图 6 去酰基缬草醛的2级（A）和3级（B）质谱图 Figure 6 The MS2 (A) and MS3 (B) spectra of desacylbaldrinal |
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图 7 去酰基缬草醛的质谱裂解途径 Figure 7 MS fragment pathways of desacylbaldrinal under positive mode |
在电喷雾离子源正离子模式下缬草醛出现[M+H]+峰，m/z 219.064 7。呈现的特征碎片离子为m/z 177.054 2（C10H9O3，100%）、m/z 158.884 9（C10H6O2，3%）、m/z 148.903 1（C9H9O2，100%）、m/z 120.862 7（C8H9O，12%）、m/z 92.872 2（C6H5O，3.4%）、m/z 78.885 8（C6H7，1.5%）等；各碎片离子归属[20]：m/z 177.054 2 [M-AC+H]+，m/z158.884 9 [M-AC-H2O+H]+，m/z 148.903 1 [M-AC-CO+H]+，m/z 120.862 7 [M-AC-2CO+H]+，m/z 92.872 2 [M-AC-3CO+H]+。缬草醛的质谱图见图 8。
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图 8 缬草醛的2级（A）和3级（B）质谱图 Figure 8 The MS2 (A) and MS3 (B) spectra of baldrinal |
由质谱分析可见：11-乙氧基缬草醛、11-甲氧基缬草醛、去酰基缬草醛和缬草醛质谱裂解途经基本一致，都形成了m/z 177、149、78等基本碎片离子，这是由C-11位醚键或酯键断裂所形成，这些特征离子可作为判断缬草醛类成分的重要依据。
另外，由质谱图可见：11-乙氧基缬草醛、11-甲氧基缬草醛出现m/z 161、m/z 133、m/z 105、的特征碎片离子，而去酰基缬草醛和缬草醛则出现m/z 131、m/z 103等特征碎片离子。这是由于去酰基缬草醛和缬草醛吡喃环母核双键的γ位置活泼氢发生重排反应后产生特征碎片离子，由此可见C-11能否形成活泼氢是区分上述2类缬草醛成分的依据。
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