2018, Vol. 38 
白芷作为常用药应用在许多中药复方中。《中华人民共和国药典》[1]规定其来源为伞形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f.或杭白芷A. dahurica（Fisch. ex Hoffm.）Benth. et Hook. f. var. formosana（Boiss.）Shan et Yuan的干燥根。目前关于白芷的化学成分研究已经较为深入，香豆素类和挥发油类被认为是白芷中的主要成分和药效成分。白芷具有广泛的药理作用，包括镇痛抗炎[2-3]，抗菌[4]，扩张血管[5]，抗癌[6]，兴奋中枢[7]等。同时，白芷又具有明显的增白[8]作用，还常用于辅助治疗白癜风等疾病。正因为在治疗疾病及美容等方面的良好效果，白芷得到了越来越广泛的应用。目前市场上的白芷为栽培品，根据产地不同，分为杭白芷（A. dahurica cv. Hangbaizhi）、川白芷（A. dahurica cv. Chuanbaizhi）、禹白芷（A. dahurica cv. Yubaizhi）和祁白芷（A. dahurica cv. Qibaizhi）等主流栽培品，还有重庆白芷、湘白芷、台湾白芷等非主流栽培品以及野生种兴安白芷。不同产地白芷在主要成分含量和比例上均具有较大的差异[9-10]。
呋喃香豆素类成分在白芷中广泛分布，许多研究[11-13]表明，白芷中的呋喃香豆素类化合物具有显著的抗炎，抗氧化，抗肿瘤等作用。在本课题组前期的研究中，从杭白芷中分离得到了一系列具有长链或短链疏水基团的呋喃香豆素类化合物[14]，即杭白芷香豆素（andafocoumarin）A~J。生物活性试验表明，杭白芷香豆素A和B具有比阳性对照药更优秀的抗炎活性。由于这类化合物在白芷中的含量较低，且极性类似，很难通过普通的高效液相色谱-紫外检测器法进行定量分析。
超高速液相色谱-质谱联用（UFLC-MS/MS）是近些年来应用比较广泛的一种技术手段，其高灵敏度及高选择性的特点能够保证对微量成分及复杂体系中多成分的准确定量分析。目前，应用LC-MS/MS技术对白芷中多种呋喃香豆素进行同时定量分析以及药代动力学分析的研究[15-17]与日俱增。笔者在前期的研究中，应用UFLC-MS/MS技术方法已测定了主流栽培品杭白芷、川白芷、禹白芷和祁白芷中的杭白芷香豆素A~H和杭白芷香豆素J共9个呋喃香豆素的含量[18]，本文报道非主流栽培品重庆白芷、湘白芷和台湾白芷等以及野生种兴安白芷中上述9个呋喃香豆素的含量测定，为其是否能等同主流栽培品白芷药用提供理论依据。
1 仪器、试药与试验材料岛津8050系列UFLC-MS/MS系统（岛津株式会社），包括岛津30AD液相系统（LC-30A二元泵、SIL-30AC自动进样器、SPD-M30A二极管阵列检测器、CTO-20AC柱温箱）和8050三重四极杆质谱检测器，LabSolution色谱工作站（version 5.6）；KQ5200超声波仪（昆山市超声仪器有限公司；功率200 W，频率40 kHz）；Milli-Q Advantage A10（Millipore，Billerica，USA）纯水机；Mettler XS105DU十万分之一电子天平（瑞士）。
对照品杭白芷香豆素A（1）、B（2）、C（3）、D（4）、E（5）、F（6）、G（7）、H（8）和J（9）由本文课题组从杭白芷根中分离制备，经NMR、MS等谱学数据鉴定其化学结构[14]（图 1），UFLC-DAD法测定纯度均大于95%；LC-MS级乙腈和甲醇购自Fisher Scientific（Pittsburgh，PA，USA）；水为超纯水（18 MΩ·cm-1），实验室自制；其余试剂均为分析纯。
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1~9.杭白芷香豆素A~H、J（andafocoumarins A，B，C，D，E，F，G，H，and J，respectively） 图 1 9个分析物的化学结构 Figure 1 The structures of 9 analytes |
本研究所用7批次不同白芷干燥根药材样品信息如表 1，凭证标本存放在北京大学天然药物及仿生药物国家重点实验室。样品S1（安徽白芷）、S2（台湾白芷）、S3（重庆白芷）、S4（湘白芷）分别由南京农业大学中药研究所郭巧生教授、中国台湾行政院农业委员会农业试验所林义恭研究员、重庆市中药研究院钟国跃研究员和湖南省药品检验研究院李文莉主任药师鉴定为Angelica dahurica var. formosana的干燥根，均为栽培品；S5、S6和S7分别由中国台湾行政院农业委员会农业试验所林义恭研究员、通化师范学院于俊林教授和黑龙江中医药大学中药资源教研室王振月教授鉴定为Angelica dahurica Benth. et Hook. f. ex Franch. et Sav.的干燥根，S5为栽培品，S6和S7均为野生品。
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表 1 7批次白芷样品信息表 Table 1 Detailed information of Angelicae Dahuricae Radix of 7 batches of samples |
液相色谱分离用Kinetex® 2.6μ C18 100 Å反相C18硅胶填料色谱柱（100 mm×2.1 mm，2.6 μm; Phenomenex Inc.，Torrance，CA，USA）。流动相为乙腈（A）和水（B），流速为0.5 mL·min-1，梯度洗脱：0~2 min，30%→40%A；2~2.01 min，40%→85%A；2.01~6 min，85%→90%A；6~10 min，90%A；10~12 min，90%→95%A。柱温保持在30 ℃，进样体积为1 μL。
质谱条件：干燥气流速10.0 L·min-1，雾化气流速3.0 L·min-1，加热气流速10.0 L·min-1，接口电压3 kV，检测器电压1.8 kV，接口加热器温度300 ℃，脱溶剂管温度250 ℃，加热模块温度400 ℃。采用电喷雾离子（ESI）正离子源检测，扫描方式为多反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）。离子化参数包括离子对信息，Q1能量、Q3能量、碰撞能量和滞留时间如表 2。
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表 2 白芷中9个呋喃香豆素的MRM优化参数 Table 2 Optimized MRM parameters of 9 standards in Angelicae Dahuricae Radix |
分别精密称取9个化合物的对照品适量，加入甲醇制成质量浓度为1 mg·mL-1的储备液，取适当体积储备液混合并稀释得到一系列浓度的混合对照品溶液，即得。
2.2.2 供试品溶液称取过40目筛的白芷粉末0.50 g，精密称定，置于具塞磨口量瓶中，精密加入甲醇溶液20 mL，超声提取（40 kHz，200 W）30 min，过0.22 μm微孔滤膜，取续滤液作为供试品溶液，即得。
2.3 方法学验证对测定方法的系统适用性、线性、检测下限和定量下限、日内精密度、日间精密度、稳定性和加样回收率进行了考察[18]。杭白芷香豆素A（1）、B（2）、C（3）、D（4）、E（5）、F（6）、G（7）、H（8）和J（9）在各自线性浓度范围内的线性回归方程的相关系数为0.996 5~0.999 9，线性范围分别为0.04~6、0.02~3、0.02~3、0.05~7.5、0.02~3、0.02~3、0.06~24、0.08~6、0.1~15 mg·mL-1；检测下限分别为0.37、0.19、0.56、0.46、0.56、2.78、1.67、1.11、2.78 ng·mL-1；定量下限分别为1.11、0.56、1.67、1.39、1.67、8.33、5.00、3.33、8.33 ng·mL-1。日内和日间精密度RSD（n=3）分别为1.4%~3.0%和3.1%~5.8%。稳定性试验中，对照品溶液和供试品溶液分别在制备后于室温25 ℃放置24 h，进样分析，其峰面积的RSD为3.2%~5.8%；低、中、高3个浓度的加样回收率在86.12%以上，RSD在6.6%以下。符合定量分析要求。
2.4 样品含量测定按照“2.2.2”项所述方法分别制备表 1中7批次样品的供试品溶液，每批次样品平行制备2份，过滤后按“2.1”项下条件进行分析。7批次样品和混合对照品的总离子MRM图见图 2。以外标法计算各批次样品中9个分析物的含量，结果见表 3。
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S1~S7.同表 1（the same as Tab. 1）1~8.杭白芷香豆素A~H（andafocoumarins A-H）9.杭白芷香豆素J（andafocoumarin J）MS.混合对照品（mixed standard samples） 图 2 7批次白芷供试品溶液在阳离子模式的代表性总离子MRM图 Figure 2 Typical total-ion multiple reaction monitor (MRM) chromatograms of sample solution for Angelicae Dahuricae Radix of 7 batches obtained in positive-ion mode |
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表 3 不同产地白芷中9个呋喃香豆素的含量 Table 3 Contents of 9 analytes in 7 batches of Angelicae Dahuricae Radix |
随着研究的逐步深入和技术的逐渐成熟，研究人员开始关注中药材中的微量药效成分的定量和体内药代动力学过程。液质联用技术自问世以来，凭借高灵敏度、高选择性等特点，使其同时对多成分，尤其是微量成分进行定量分析成为可能；借助更小粒径的色谱柱，能够保证对极性相似化合物的分离，并大大缩短了分析时间。所有这些优点，使得液质联用技术在中药多成分同时定量和药代动力学研究中备受青睐。本研究建立了利用UFLC-MS/MS对白芷中9个结构新颖的呋喃香豆素同时进行定量的分析方法，经过优化和调整流动相组成以及梯度洗脱方法，最终实现了对包括3对同分异构体在内的9个呋喃香豆素（图 1）的准确定量，且所有分析物均具有良好的分离度。随后，又对该方法的质谱参数进行了优化，以保证所有分析物均具有最高的响应。通过比较，发现9个呋喃香豆素在正离子模式下具有更好的响应。而在MRM的优化中，针对具体分析物对Q1能量、Q3能量、碰撞能量和滞留时间进行了调整，保证了每个分析物均具有良好的峰形及响应。
3.2 提取条件的优化由于9个呋喃香豆素在白芷中的含量相对较低，同时具有长链的疏水基团，因此需要重点考察、优化提取方法。最初，为了尽可能完全提取这些成分，选择乙醇作为提取溶剂进行加热回流提取，每次提取2 h，连续提取3次。分别收集3次的提取液并进行UFLC-MS/MS分析，结果表明所有分析物经过一次回流已能够提取完全。随后，为简化操作，本研究又对超声提取方法进行了考察。通过优化提取溶剂和提取时间，并与回流提取结果进行比较，最终确定甲醇超声作为最终的提取方法。
3.3 含量测定结果白芷中分布有大量的呋喃香豆素类化合物，这些成分具有重要的药理作用[19]。其中的一系列具有长链或短链疏水基团的呋喃香豆素[14]，无论是在化学结构上还是在理化性质上，均与白芷中常见的香豆素有很大不同。在抑制脂多糖所致RAW264.7巨噬细胞释放一氧化氮的生物活性试验中，杭白芷香豆素A（1）和B（2）具有良好的活性，甚至超过了阳性对照药，比白芷中常见的呋喃香豆素活性更强[19]，揭示了其潜在的抗炎作用。由于杭白芷香豆素A~J最初是从杭白芷分离鉴定的[14]，故有杭白芷香豆素之名。为考察它们在其他白芷中的分布，非常有必要对这一类成分进行测定。如表 3所示，同时结合四大白芷（杭白芷、川白芷、禹白芷、祁白芷）中的测定结果[18]，证明杭白芷香豆素A~H和J这9个成分在白芷中均有分布，为共有成分，但在不同产地白芷中的含量差异比较大，这可能与产地等有密切关系，具体的原因尚需进行进一步的系统考察。杭白芷香豆素A和B在湘白芷中的含量相对较高，其他几个成分也在湘白芷中分布较多。S2为栽培在中国台湾台中的杭白芷，S5为栽培在中国台湾花莲县的兴安白芷，两者物种不同，总体趋势是S5中的杭白芷香豆素A、B、C、D、E和J的含量高于S2中的含量，而杭白芷香豆素F、G和H的含量大大低于S2中的含量，此与物种关系密切。S6和S7分别是吉林省和黑龙江省的野生兴安白芷，9个成分含量的总体趋势是吉林省产者高于黑龙江省产者。通过本研究并结合前期测定结果[18]，初步阐明了9个新型呋喃香豆素在不同产地白芷中的分布情况，进而为白芷的临床合理应用提供了一定的参考和依据。
兴安白芷在我国北方、原苏联远东地区、朝鲜、韩国等分布量较大，但均为野生品。兴安白芷是上述9个新型呋喃香豆素的资源物种。
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