鱼肝油是从鳕鱼等深海鱼类肝脏中提取的一种脂肪油，其主要功效成分为维生素A与维生素D^[1]。维生素A是一系列，包括视黄醇(图 1)、视黄醛、视黄酸和视黄醇酯等在内的视黄醇衍生物的统称，对细胞分化、胚胎发育、视觉感受等多个生理功能发挥重要影响^[2]，此外还有研究表明维生素A对于癌症预防有积极作用^[3-4]。鱼肝油中的维生素A主要以视黄醇高级脂肪酸酯的形式存在^[5]。目前对维生素A酯的分析报道较少，主要集中于生物样品^[6]与食品^[7-8]，尚未见鱼肝油中维生素A酯的分析报道。鱼肝油在国内外药典中均有收载，其中国外药典^[9-11]均采用皂化法检测维生素A，该方法简单易行，但无法区分不同种类的维生素A酯。中国药典^[1]采用正相色谱法测定维生素A醋酸酯，未对其他种类的维生素A酯做控制。有文献报道^[12]天然鳕鱼肝油主要含维生素A棕榈酸酯(图 1)，但目前国内市售鳕鱼肝油基本多为维生素A醋酸酯的制品。此外，常见鱼肝油除鳕鱼肝油外，还有金枪鱼肝油等，不同来源的鱼肝油维生素A酯组成是否一致尚未见文献报道。因此，建立一个可以分离鉴定鱼肝油中多种维生素A酯的分析方法对于鱼肝油的质量控制有着重要意义。

本研究采用非水反相色谱法(NARP法)分离鱼肝油中的维生素A酯组分，结合对照品比对和飞行时间质谱(TOF/MS)，共分离鉴定了3种鱼肝油中16种维生素A酯，为鱼肝油质量控制提供参考依据。

1 仪器与试药

LC-20AD高效液相色谱仪(Labsolutions Version 6.43 SP2数据处理系统，岛津公司)；1290 Infinity液相色谱-6538Q TOF四极杆飞行时间质谱仪(Masshunter qualitative analysis B.04.00数据处理系统，安捷伦公司)；Inertsustain C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；岛津公司)。

鳕鱼肝油由企业A提供，鳕鱼肝油胶囊由企业B提供，金枪鱼肝油由企业C提供。异丙醇与乙腈为色谱纯。对照品维生素A醋酸酯(批号100368-201502)购自中国食品药品检定研究院，维生素A油酸酯(批号14-THT-179-1)、维生素A棕榈酸酯(批号2-MWC-189-1)与维生素A硬脂酸酯(批号23-CF-173-3)均购自Toronto Research Chemicals。

2 实验条件 2.1 液相色谱条件

采用Inertsustain C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以乙腈-异丙醇(8:2)为流动相，流速1.0 mL·min^-1，检测波长328 nm，柱温25 ℃，进样量20 μL。

2.2 质谱条件

采用电喷雾正离子化(ESI⁺)检测，喷雾电压4 kV，雾化气压力240 kPa，干燥气流量10 L·min^-1，去溶剂温度350 ℃，碎片电压175 V；质量数扫描范围m/z 100~650。

2.3 溶液制备

取鱼肝油或胶囊内容物约0.5 g，置50 mL量瓶中，加异丙醇约10 mL，超声(360 W，40 kHz)5 min，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，过滤，取续滤液作为供试品溶液。取维生素A醋酸酯、维生素A油酸酯、维生素A棕榈酸酯与维生素A硬脂酸酯对照品各约5 mg，置同一100 mL量瓶中，加异丙醇约10 mL，超声(360 W，40 kHz)5 min，用异丙醇稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液。

3 结果 3.1 维生素A酯的色谱分离

按照“2.1”和“2.2”项下的条件分别对混合对照品溶液与供试品溶液进行分析，结果见图 2、3。本试验所用鳕鱼肝油和鳕鱼肝油胶囊分别只含维生素A醋酸酯和维生素A棕榈酸酯，两者差异明显，与文献报道情况^[12]一致；金枪鱼肝油中维生素A酯组成更为多样，除已知的维生素A油酸酯、棕榈酸酯和硬脂酸酯外，还有多个较大的维生素A酯峰，需做进一步鉴定。

3.2 维生素A酯的质谱鉴定

由于市售维生素A酯对照品种类有限，本研究采用高分辨质谱(TOF/MS)，结合维生素A酯的结构特点，鉴定未知维生素A酯的结构。

通过ESI⁺-TOF/MS对维生素A棕榈酸酯对照品做一级质谱分析，结果见图 4。维生素A棕榈酸酯主要产生m/z 269与524这2个信号峰，前者为源内裂解脱去棕榈酸的加氢离子(C₂₀H₂₉⁺，-0.8×10^-6)，与文献报道情况一致，m/z 269为维生素A酯的特征离子^{[7, 14]}；后者为脱电子的分子离子(C₃₆H₆₀O₂^·+，6.3×10^-6)。以上质谱特征对于推测未知维生素A酯提供了参考依据。

采用同样的方法对金枪鱼肝油做一级质谱分析，提取每个色谱峰的质谱图，其中均有m/z 269离子，进一步表明其色谱图中14个色谱峰均为维生素A酯峰，并根据分子离子精确分子量推测相应分子式，结合维生素A酯的结构特征，如组成元素为C、H、O，O原子数为2，最小不饱和度为7等，共鉴定出15种维生素A酯(峰4中检测到2种维生素A酯信号)，相关色谱质谱数据、推测分子式、结合的脂肪酸简式、推测脂肪酸类型以及相对百分含量(面积归一化法)见表 1。其中以峰2、3、6、10与11占比最大，其推测分子式分别对应EPA酯、DHA酯、棕榈油酸酯、油酸酯与棕榈酸酯。EPA与DHA是人体不能合成的高级不饱和脂肪酸，在深海鱼中的含量很高^[15]。

4 讨论

药典与文献中维生素A酯的液相色谱分离方法包括正相色谱^[1]和非水反相色谱(NARP)^[6-8]，使用到的流动相包括正己烷^{[1, 7]}、二氯甲烷^[6]和三氯甲烷^[8]等。考虑到液相耐受与质谱兼容等问题，本实验优先选择反相色谱法。由于不同种类维生素A酯结构类似且极性较小，在含水流动相中保留过强且无法有效分离。故参考用于食用油中甘油三酯分析的非水反相色谱条件^[13]，以乙腈-异丙醇为流动相，结果维生素A酯的保留情况与分离度均得到有效改善，综合考虑分析周期与分离度，最终选择乙腈-异丙醇(8:2)的条件。同时考察柱温对色谱行为的影响，发现柱温越低，保留越强，分离度越高，最终选择25 ℃柱温。

维生素A酯极性较低，相对分子质量较大，结构上适用于大气压化学电离源(APCI)检测^{[7, 14]}，但本试验考察发现APCI条件下维生素A酯的源内裂解过强，难以检测到分子离子峰信号，在调节源内温度、去簇电压等参数未能有效改善的情况下，尝试使用ESI源，结果发现虽然整体离子响应弱于APCI，但母离子源内裂解相对较少，分子离子信号相对较强，因此最终选择ESI源。之后在流动相中加入0.05%的甲酸，离子化效率得到进一步提高，各组分保留时间未受影响。

结合各组分鉴定结果与保留时间，发现维生素A酯在非水反相色谱上的保留行为类似甘油三酯，会受等效碳数(equivalent carbon number，ECN)影响^[13]，即酰基链总碳数减去2倍的双键数。等效碳数越大，保留时间越长；等效碳数相同，保留时间相近，如20:5和22:6，18:3和16:2。且分析同系物保留时间发现，相邻同系物的保留时间之比均约为0.84(见表 2)，说明维生素A酯在非水反相色谱条件下保留行为有明显规律，这些规律可以对推测未知维生素A酯的保留时间及结构鉴定提供帮助。