复方桔梗麻黄碱糖浆(Ⅱ)为非处方药类止咳祛痰药，主要成分有盐酸麻黄碱、氯化铵、桔梗流浸膏，用于治疗咳嗽、多痰，也可用于喘息性支气管炎引起的咳嗽。本品为糖浆剂，易于服用，止咳效果明显，常被作为小儿用药。为保证产品的稳定性，处方中规定苯甲酸的用量为0.15%；中国药典2015年版附录0116糖浆剂中规定山梨酸和苯甲酸的用量不得过0.3%，羟苯酯类的用量不得过0.05%。为了解该品种市售产品对防腐剂的使用情况，本文建立了能同时测定苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、脱氢乙酸7种防腐剂含量的高效液相色谱检测方法，并用该方法对市售的4个厂家43个批次复方桔梗麻黄碱糖浆(Ⅱ)样品进行了筛查。

1 仪器与试药 1.1 仪器

Waters公司e2695高效液相色谱仪，包括四元泵、自动进样器、柱温箱、二极管阵列检测器(DAD)和Empower 2化学工作站；SHISEIDO公司CAPCELL MGⅡ C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)；梅特勒-托利多公司XS205DU型电子天平。

1.2 试药

对照品苯甲酸(批号100419-201302 ID29QF-9HGN，含量100%)、山梨酸钾(批号101075-200901 IDNH85-2JXZ，含量100%)、对羟基苯甲酸甲酯(批号100278-201103 IDCO3A-9LN6，含量99.6%)、对羟基苯甲酸乙酯(批号00847-201102 IDOXC4-7B21，含量99.9%)、对羟基苯甲酸丙酯(批号100444-200401，含量100%)及对羟基苯甲酸丁酯(批号110792-200503 IDCMA9-RJ4M，含量100%)购自中国食品药品检定研究院，脱氢乙酸(批号SB05-261-2011，含量1 000 μg·mL^-1)购自农业部环境保护科研监测所。甲醇为色谱纯(默克公司)，醋酸铵为分析纯(广东省化学试剂工程技术研究开发中心)，冰醋酸为分析纯(国药集团化学试剂有限公司)。NG、HT、SL、BL 4个生产企业共计43个批号的样品为市售。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用SHISEIDO公司CAPCELL MGⅡ C₁₈色谱柱(250 mm×4.6 mm，5 μm)，以0.02 mol·L^-1醋酸铵溶液(冰醋酸调pH至4.0)为流动相A，甲醇为流动相B，梯度洗脱(0~5 min，流动相A从80%降至55%，保持25 min；30~35 min，流动相A从55%升至80%，保持10 min)，流速1.0 mL·min^-1，检测波长255 nm(苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯)、308 nm(脱氢乙酸)，进样量20 μL。

2.2 对照品储备液与供试品溶液的配制

分别精密称取苯甲酸、山梨酸的对照品各10 mg，用50%甲醇溶液溶解并稀释至10 mL，摇匀，即得对照品储备液；精密称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的对照品各10 mg，分别用50%甲醇溶液溶解并稀释至25 mL，摇匀，即得对照品储备液；精密称取盐酸麻黄碱对照品10 mg，用50%甲醇溶液溶解并稀释至100 mL，得含盐酸麻黄碱0.1 mg·mL^-1的对照品储备液。精密称取样品适量(约相当于盐酸麻黄碱0.8 mg)，用50%甲醇溶液稀释至25 mL，摇匀，即得供试品溶液。

2.3 阴性样品的制备

取处方量的糖加适量水溶解后，加入氯化铵、枸橼酸钠、枸橼酸，搅拌使溶解，然后依次加入桔梗流浸膏、薄荷脑(用处方量乙醇先溶解)、茴香水，搅拌使混匀，加水至1 000 mL，即得缺盐酸麻黄碱与苯甲酸的阴性样品溶液。阴性样品各成分使用量见表 1，阴性样品溶液分别在255 nm和308 nm测定的HPLC图见图 1。

2.4 线性关系考察 2.4.1 6种防腐剂的混合对照品溶液的制备

分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各0.1 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备液各0.05 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液30 mL，阴性样品溶液4 mL，用50%甲醇溶液稀释至200 mL，摇匀，即得混合对照品溶液①；分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各0.05 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备液各0.025 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液3 mL，阴性样品溶液0.4 mL，用50%甲醇溶液稀释至20 mL，摇匀，即得混合对照品溶液②；分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各0.1 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备各0.05 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液3 mL，阴性样品溶液0.4 mL，用50%甲醇溶液稀释至20 mL，摇匀，即得混合对照品溶液③；分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各0.5 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备液各0.1 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液3 mL，阴性样品溶液0.4 mL，用50%甲醇溶液稀释至20 mL，摇匀，即得混合对照品溶液④；分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各1 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备液各0.5 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液3 mL，阴性样品溶液0.4 mL，用50%甲醇溶液稀释至20 mL，摇匀，即得混合对照品溶液⑤；分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各2 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备液各1 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液3 mL，阴性样品溶液0.4 mL，用50%甲醇溶液稀释至20 mL，摇匀，即得混合对照品溶液⑥；分别量取苯甲酸对照品储备液和山梨酸对照品储备液各5 mL，对羟基苯甲酸酯类对照品储备液各1 mL，盐酸麻黄碱对照品储备液3 mL，阴性样品溶液0.4 mL，用50%甲醇溶液稀释至20 mL，摇匀，即得混合对照品溶液⑦。

2.4.2 脱氢乙酸对照品溶液的制备

分别精密量取脱氢乙酸对照品0.04、0.08、0.1、0.4、0.8、1.0 mL，与盐酸麻黄碱储备液0.3 mL混合后用50%甲醇溶液分别稀释至20 mL，摇匀，即得系列脱氢乙酸对照品溶液①~⑥

2.4.3 线性关系考察结果

精密量取上述系列混合对照品溶液及系列脱氢乙酸对照品溶液，分别进样，记录色谱图。以质量浓度C为横坐标，峰面积A为纵坐标，绘制标准曲线，求得线性方程，结果见表 2，表明苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯及脱氢乙酸在相应的浓度范围内线性关系均良好。

2.5 回收率考察

按表 3分别量取苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类、脱氢乙酸及盐酸麻黄碱的对照品储备液及阴性样品溶液适量，混合，用流动相分别稀释至20、20、200 mL，制得高、中、低3个浓度的供试溶液共9份，分别进样测定，结果见表 4~10。苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、脱氢乙酸高、中、低浓度的平均回收率(n=9)分别为106.0%、99.1%、98.3%、101.6%、99.9%、100.1%、112.9%。

2.6 进样精密度考察

取线性关系考察项下混合对照品溶液⑤、脱氢乙酸对照品溶液④连续5次进样，结果见表 11。表明仪器稳定性符合要求。

2.7 溶液稳定性考察

取线性关系考察项下混合对照品溶液⑤、脱氢乙酸对照品溶液④在12 h内每隔3 h进样1次，结果见表 11。表明溶液在12 h内稳定。

2.8 检测限和定量限

取线性关系考察项下混合对照品溶液①、脱氢乙酸对照品溶液④进样，记录色谱图。用信噪比为3及10来确定各化合物的检测限与定量限，结果见表 12。

2.9 样品测定结果

对市售NG、HT、SL、BL 4个生产企业共计43个批号的样品进行了检测，结果均未检出山梨酸、对羟基苯甲酸酯类及脱氢乙酸；处方中规定苯甲酸的用量为1.5 g·L^-1，考察结果显示企业NG的苯甲酸平均标示含量为104.4%，企业SL的苯甲酸平均标示含量为106.6%，2家企业的样品中的苯甲酸含量均符合处方要求；企业HT的苯甲酸平均标示含量仅为81.0%，企业BL的苯甲酸平均标示含量为209.4%，用量是处方量的2倍，严重超标。7种防腐剂对照品的色谱图及样品典型色谱图见图 2。

3 讨论 3.1 波长的选择

用DAD检测器对苯甲酸对照品溶液、山梨酸对照品溶液、对羟基苯甲酸甲酯对照品溶液、对羟基苯甲酸乙酯对照品溶液、对羟基苯甲酸丙酯对照品溶液、对羟基苯甲酸丁酯对照品溶液、脱氢乙酸对照品溶液、盐酸麻黄碱对照品溶液进行扫描，结果苯甲酸、山梨酸、脱氢乙酸的最大吸收波长分别为231、258、308 nm，对羟基苯甲酸酯类的最大吸收波长均为255 nm，盐酸麻黄碱的吸收波长为205 nm，综合考虑，选择255 nm作为苯甲酸、山梨酸、对羟基苯甲酸酯类的测定波长；脱氢乙酸在255 nm波长处时为峰谷，因此选择308 nm作为其测定波长。上述8种对照品溶液的紫外扫描图见图 3。

3.2 流动相的选择

以国家标准^[1-7]和相关文献^[8-15]作为参考，对0.02 mol·L^-1醋酸铵-甲醇、1.16%醋酸铵溶液-甲醇、0.025 mol·L^-1磷酸二氢钠溶液-甲酸、0.1%磷酸溶液-甲醇等流动相进行了考察，结果用0.02mol·L^-1醋酸铵-甲醇进行梯度洗脱，得到的各成分色谱峰出峰时间、响应值、峰形及分离度均最佳，故选其作为本研究的流动相。

3.3 流动相pH的选择

采用反相色谱法分离酸性或碱性样品时，通过调节流动相的pH，可以抑制待测组分的解离，增加组分在固定相上的保留，从而获得好的、尖锐的峰形和适宜的保留时间。一般来说，会以高于或低于待测组分pk_a 2个单位的标准进行选择。本次研究待测的7种防腐剂中对羟基苯甲酸酯类和脱氢乙酸受pH的影响均极小，苯甲酸、山梨酸均为有机弱酸，pk_a分别为4.21和4.76，同时考虑色谱柱的pH耐受程度，将流动相的pH定为4.0。