2018, Vol. 38 
蛋白类药物因其疗效好且毒性低，目前已成为全球医药市场上增速最快的药物种类之一，具有巨大的市场前景。但是此类药物半衰期短，需频繁注射，且易产生免疫原性而限制了其应用。聚乙二醇化(pegylation，PEG)蛋白类药物在最大限度地保留其生物活性的同时，降低其免疫原性，延长半衰期，使用更方便，临床应用上更受欢迎[1]。
传统的聚乙二醇修饰多为随机修饰，选择性不高，修饰后的蛋白分子不均一，活性降低等。而定点修饰有利于保持蛋白质或多肽的活性，能获得某一特定修饰位点均一的聚乙二醇化产物，有利于产品质量控制和工业化生产，已成为聚乙二醇修饰蛋白质、多肽类药物的研究热点[2-3]。
微生物谷氨酰胺转氨酶(microbial transgluta-minase，MTGase)能催化PEG对蛋白或多肽的某些特定氨基酸进行定点修饰。其优势在于不需要对原蛋白的结构进行改造，最少程度地影响原蛋白药的理化和结构特性，而且可用E. coli工程菌表达，来源方便，还能简化下游纯化工艺，降低生产成本[4-5]。而在MTGase连接的聚乙二醇化蛋白类药物的质量控制中，有必要对残留的MTGase进行检测[6]。本文采用双抗体夹心ELISA法，以聚乙二醇重组人干扰素α2a(PEG-IFNα2a)为例，建立了灵敏、快速的MTGase残留量测定方法，并按照2015年版中国药典要求验证了该方法的定量限、精密度和准确度、稀释可靠性、稳定性和专属性等，对3批PEG-IFNα2a原液进行了重复测定。
1 仪器与试药 1.1 耗材与仪器Synergy HT酶标仪和Elx405洗板机为BioTek公司产品；酶标板(货号9018)购自Corning公司。
1.2 药品与试剂供试品PEG-IFNα2a原液由石药集团中奇制药技术(石家庄)有限公司制备；包被液(碳酸盐缓冲液，pH 9.4，货号28382，批号ME157723A)为Thermo公司产品；山羊抗兔IgG F(ab)’2-HRP(货号A24537，批号46-22-020315)为Novex公司产品；TMB双组分显色试剂盒(货号TS0001，批号20150825)为天舜生物科技有限公司产品；MTGase对照品(10 mg·mL-1，批号20131014)、MTGase单抗(批号20150622)、MTGase兔多抗(批号20150504)均由Dophen Biomed Corporation提供。
2 实验方案 2.1 实验步骤 2.1.1 试剂配制磷酸盐缓冲液(PBS)：氯化钠8.0 g，磷酸氢二钠1.44 g，氯化钾0.2 g，磷酸二氢钾0.2 g，1 L纯水溶解，调pH至7.4；封闭液：含1%牛血清白蛋白(BSA)的PBS；样品稀释液：含0.1%BSA的PBS；洗涤缓冲液：PBST，含0.05%吐温-20的PBS；终止液：2 mol·L-1硫酸。
2.1.2 标准曲线的制备用包被液将MTGase单抗稀释至2 µg·mL-1，每孔100 µL，室温震荡8 h，4 ℃封闭过夜后，PBST洗板3次；用样品稀释液3倍系列稀释MTGase对照品，制备质量浓度分别为40.00、13.33、4.44、1.48、0.49、0.16、0.05 ng·mL-1的标准样品，每孔100 µL，室温震荡1 h后，PBST洗板3次；加入5 000倍稀释的MTGase兔多抗，每孔100 µL，室温震荡1 h后，PBST洗板3次；加入山羊抗兔IgG F(ab)’2-HRP，3 000倍稀释，每孔100 µL，室温震荡1 h后，PBST洗板3次，PBS洗板1次；TMB显色3~5 min后加终止液终止反应，酶标仪450 nm读数，制备标准曲线，选用的回归模型为四参数方程。
2.2 方法学验证实验方案 2.2.1 方法的定量限将MTGase对照品稀释至13.33、10、0.165和0.055 ng·mL-1，按照“2.1.2”项的方法对4个浓度的溶液板内重复5次测定，计算精密度和准确度，按照《生物样品定量分析方法验证指导原则》[7]要求，定量限的准确度应在±20%以内，精密度小于20%。
2.2.2 方法的重复性按照“2.1.2”项下方法制备高、中、低3个浓度(4.44、1.48和0.49 ng·mL-1)的MTGase质控样品，板内每个质控浓度重复测定10次；板间每个质控浓度3个平行，重复3次测定；计算其精密度和准确度。
2.2.3 稀释可靠性根据该方法的检测范围，样品检测前需进行稀释，因此应进行方法的稀释可靠性考察。用样品稀释液将质量浓度为40 ng·mL-1的标准样品分别稀释10、20、80、160倍后，得到4、2、0.5、0.25 ng·mL-14个浓度的质控样品，按照“2.1.2”项的方法，每个浓度重复测定5次，计算准确度和精密度。
2.2.4 稳定性考虑到样品分装及部分样品需要重复检测，有必要考察其冻融稳定性。用样品稀释液配制高、中、低3个浓度(4.44、1.48和0.49 ng·mL-1)的质控样品，冻融1次和3次后进行检测；另外，样品在检测过程中需要在室温(20~30 ℃)放置一段时间，因此需要对其室温放置稳定性进行考察，将配制的高、中、低3个浓度(4.44、1.48和0.49 ng·mL-1)的质控样品室温放置2 h后进行测定。每个浓度5次重复测定，样品的回收率应在理论值的80%~120%之间。
2.2.5 专属性检测PEG-IFNα2a原液中MTGase残留，需对该方法进行专属性验证。溶液Ⅰ：用样品稀释液将PEG-IFNα2a原液稀释2.5、5、10、20和40倍备用，5、10、20和40倍稀释的供试品即为溶液Ⅰ；溶液Ⅱ：上述2.5、5、10和20倍稀释的供试品和5 ng·mL-1的标准样品分别等量混合即为溶液Ⅱ，重复测定3次；溶液Ⅲ：用样品稀释液2倍稀释5 ng·mL-1的标准样品，重复6次测定。溶液Ⅰ与溶液Ⅱ的含量之差应在溶液Ⅲ含量测定值的95%可信区间内(x±2SD)，表明供试品不会对该检测法产生干扰作用。当结果大于可信区间时，提示样品或缓冲液对检测有增强作用；当结果小于可信区间时，提示样品或缓冲液对检测有抑制作用[8]。
2.3 样品检测取3批PEG-IFNα2a原液，用样品稀释液10倍稀释样品，按照“2.1.2”项的方法操作，测定MTGase残留，每批样品重复测定3次，每次3个平行，计算板内和板间精密度。
3 实验结果 3.1 标准曲线在标准曲线0.05~40 ng·mL-1范围内，将质量浓度对数值和吸收值进行经四参数拟合，得到一条S型曲线，曲线R2 > 0.99(图 1)，供试品吸收值经曲线方程计算可得对应的含量。
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图 1 对照品浓度吸光度曲线拟合 Figure 1 Standard curve fitting of concentration absorbance of the control |
应用本方法对13.33、10、0.165和0.055 ng·mL-1 MTGase溶液板内重复5次测定，结果13.33 ng·mL-1溶液测定平均值为12.38 ng·mL-1，精密度为24.09%(n=5)，准确度为-7.13%(n=5)，精密度大于20%，不符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》对定量上限的要求；10 ng·mL-1溶液测定平均值为9.26 ng·mL-1，精密度5.22%(n=5)，准确度-7.43%(n=5)，绝对值均在20%以内。0.055 ng·mL-1溶液测定平均值为0.071 ng·mL-1，精密度为12.68%(n=5)，准确度为29.09%(n=5)，准确度大于20%，不符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》对定量下限的要求；0.165 ng·mL-1溶液测定平均值为0.166 ng·mL-1，精密度1.79%(n=5)，准确度0.60%(n=5)，均在20%以内，因此将该方法定量上限设为10 ng·mL-1，定量下限设为0.165 ng·mL-1。
3.2.2 方法的重复性高、中、低浓度的质控样品分别进行板内10次和板间3次重复检测，计算出其板内精密度2.50%~5.89%(n=10)，准确度-1.93%~-4.53%(n=10)；3次测定的板间精密度和准确度见表 1，其板内和板间精密度和准确度均在(±)15%以内，符合《生物样品定量分析方法验证指导原则》对该检测方法的要求。
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表 1 方法的板间重复性 Table 1 The reproducibility of the method between plates |
40 ng·mL-1的标准样品分别稀释10、20、80、160倍后得到4、2、0.5和0.25 ng·mL-1 4个浓度，每个浓度测定5次，结果各稀释度精密度在4.19%~7.49%(n=5)之间，准确度-5.76%~-12.28%(n=5)，可见应用本方法测定的准确度在±15%以内，精密度小于15%，表明不同稀释倍数对该检测方法无显著影响。
3.2.4 稳定性稳定性验证结果见表 2、3所示，高、中、低浓度质控样品冻融1次和3次或室温放置2 h后，分别重复测定，每个浓度测定5次。结果显示应用本方法测定的精密度在1.00%~9.82%之间，回收率在83.1%~116.7%之间，表明MTGase在以上存放条件下是稳定的。
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表 2 冻融稳定性 Table 2 Stability of the freeze-thaw |
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表 3 室温放置稳定性 Table 3 The stability at RT |
取溶液Ⅲ(2.5 ng·mL-1)共检测6次，计算均值(x=2.63 ng·mL-1)和标准偏差(SD=0.08)，加了对照品的溶液Ⅱ和相应倍数稀释的溶液Ⅰ的差值(见表 4)位于x±2SD区间(2.47~2.79 ng·mL-1)内，检测结果位于添加量2.5 ng·mL-1的80%~120%之间，说明不同倍数稀释的PEG-IFNα2a原液对该方法均无干扰。
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表 4 方法的专属性 Table 4 The specificity of the method |
按照已建立的方法检测3批PEG-IFNα2a原液中MTGase残留，结果见表 5，可见本方法测定的3批样品板内和板间精密度均低于15%，3批样品中MTGase的残留量均低于总蛋白含量的0.01%，符合本实验室对MTGase残留量的要求。
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表 5 3批PEG-IFNα2a原液中MTGase残留 Table 5 The MTGase residues in three batches of PEG-IFNα2a solution |
谷氨酰胺转氨酶(transglutaminase，TGase)广泛存在于动物、植物和微生物体内，可催化蛋白质与伯胺间的酰基转移反应，形成ε-(γ-谷酰基)-赖氨酸键，被称为天然生物粘合剂[9]。Sato等[10-11]于1996年发现TGase可用于蛋白的定点修饰，2001年又利用MTGase对此连接反应进行了优化。MTGase相对其他来源的TGase而言，因其可通过发酵大量获得，来源方便，生产成本相对低廉，并且其活性对Ca2+无依赖性，底物范围更广等优点而被广泛应用[12-13]。
通过MTGase酶催化蛋白修饰技术，不仅仅是对干扰素，可以对一系列的蛋白或抗体药物进行修饰，在不改变蛋白或抗体结构的基础上对蛋白或多肽的某些特定氨基酸进行定点修饰，提高产品的稳定性。
ELISA法，自1971年Engvall和Permann首次建立以来，发展十分迅速，目前已被广泛应用于生物学和医学科学的许多领域。ELISA法以免疫反应为基础，将抗原抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用结合起来，具有灵敏高和特异性强等优点，并且结果准确，重复性好，方法操作简单且样品处理量大，现已成为药物残留分析中常用的分析技术之一[14]。国内外对MTGase检测技术的研究尚少，李轶等人建立了MTGase含量的检测方法，但该方法定量下限为0.6 μg·mL-1，线性检测范围为0.6~10 μg·mL-1 [15]，不能满足痕量MTGase的检测要求。本实验室建立的MTGase残留量检测方法，线性检测范围为0.165~10 ng·mL-1，检测范围广，定量下限远低于已有的方法。对该方法按照中国药典的要求进行了方法学验证，结果表明该方法在0.05~40.0ng·mL-1范围内拟合良好，其精密度、准确度、专属性和稳定性等均符合指导原则的要求。应用该方法对PEG-IFNα2a原液进行了测定，结果表明PEG-IFNα2a对MTGase残留量的检测不存在干扰，该方法能稳定测定PEG-IFNα2a中MTGase的残留量，在用于其他MTGase偶联药物中MTGase残留量的检测时仅需补充专属性验证即可，是MTGase残留量检测的理想方法。
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