2018, Vol. 38 
表1(Table 1)
2. 中南大学湘雅医院普外科, 长沙 410008;
3. 湖南省药品检验研究院, 长沙 410001
2. Department of General Surgery, Xiangya Hospital, Central South University, Changsha 410008, China;
3. Hunan Institute for Food and Drug Control, Changsha 410001, China
猴头菌丝体原名猴头菌培养物[1]，现行标准收载于中国药典2015年版一部猴头健胃灵片制剂项下[2]，是猴头健胃灵片和猴头健胃灵胶囊的主要成分。目前有关猴头菌丝体的文献报道主要集中在其多糖方面[3-4]；研究表明，猴头菌多糖具有多种生物活性和药理作用，能增强巨噬细胞的吞噬功能，促进溶血素的形成，抗白细胞下降，降血糖，抗凝血，抗血栓，抗突变和抗衰老等。因此，猴头菌多糖备受人们关注，成为近年来分子生物学、医药、食品科学等领域研究和开发应用的热点。但猴头菌丝体除含有多糖、多肽、活性纤维素酶及镁、锌、硒微量元素等外，还含有丰富的氨基酸类成分。氨基酸是组成蛋白质的基本单元，同时又是人体所必需的营养物质，对人体疾病和康复起着极为重要的作用，因此，测定猴头菌丝体中氨基酸的含量对猴头菌丝体的开发和利用具有十分重要的意义。
目前，氨基酸的检测技术种类繁多，传统的氨基酸分析方法主要是阳离子交换色谱法[5]，该法操作烦琐，成本较高；目前多采用柱前衍生化反相高效液相色谱法[6-7]或毛细管电泳法[8-9]，这2种方法前处理复杂，均需对供试品进行衍生化，并且分析时间较长；随着技术的发展，也有报道采用质谱法测定氨基酸的含量[10-15]，但猴头菌丝体中氨基酸的含量测定未见有报道。本文采用UPLC-MS/MS法对猴头菌丝体中18种游离氨基酸含量直接进行测定，方法简便、快速，灵敏度高，重复性好，实用性强，为进一步控制该药品的质量提供了技术参考。
1 仪器与试药岛津LC-MS-8030液相色谱-串联质谱联用仪，Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 µm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；赛默飞世尔公司），HU20600F超声波清洗仪（300 W，25 kHz；上海珂淮仪器有限公司）。
氨基酸对照品：谷氨酸（Glu，批号140690-201203）、丝氨酸（Ser，批号140688-200401）、甘氨酸（Gly，批号140689-201103）、精氨酸（Arg，批号140685-201104）、苏氨酸（Thr，批号140682-200401）、丙氨酸（Ala，批号140680-201002）、脯氨酸（Pro，批号140677-201206）、缬氨酸（Val，批号140681-201202）、异亮氨酸（Ile，批号140683-200401）、亮氨酸（Leu，批号140687-201102）、苯丙氨酸（Phe，批号140676-200405）、盐酸赖氨酸（Lys，批号140673-201207）、盐酸组氨酸（His，批号140693-200401）、甲硫氨酸（Met，批号140684-201102）、L-酪氨酸（Tyr，批号111577-200201）、色氨酸（Trp，批号140686-201303）、瓜氨酸（Cit，批号110875-201607）均购自于中国食品药品检定研究院；L-天门冬氨酸（Asp，批号120909，含量≥98%），购于上海士锋生物科技有限公司。
猴头菌丝体由湖南新汇制药股份有限公司提供，共9批样品，批号分别为20150301、20150401、20130625、20150119、20141229、20141217、20141224、20141122、20150302。
乙腈为色谱纯试剂，水为超纯水，其他试剂均为分析纯（国药集团化学试剂有限公司）。
2 方法与结果 2.1 色谱-质谱条件色谱柱：Thermo Hypersil GOLD C18色谱柱（100 mm×2.1 mm，1.9 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%甲酸溶液（B），梯度洗脱（0~4 min，100%B；4~5 min，100%B→85%B，维持3 min）；流速：0.2 mL·min-1；柱温：40 ℃；进样量：3 μL。离子源：电喷雾离子源（ESI）；离子化模式：正离子模式；多反应监测（MRM）；源电压：4 kV；脱溶剂温度：300 ℃；加热模块温度：400 ℃；雾化气：3.0 L·min-1；干燥气：10 L·min-1；其他条件见表 1。
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表 1 18种氨基酸质谱参数 Table 1 MS parameters of 18 amino acids |
精密称取18种氨基酸的对照品适量，分别置25 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，制得约1 mg·mL-1单一成分的溶液，即得。
2.3 供试品溶液的制备取本品约0.2 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水约90 mL，超声处理（300 W，25 kHz）20 min，放冷，加水至刻度，摇匀，滤过，精密吸取续滤液5 mL，置50 mL量瓶中，加水稀释至刻度，摇匀，即得。
2.4 测定方法分别精密吸取对照品溶液和供试品溶液各3 μL，注入液-质联用仪，测定，记录色谱图（见图 1）。
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图 1 18种氨基酸MRM色谱图 Figure 1 MRM chromatograms of 18 amino acids |
分别精密量取上述各氨基酸对照品储备液适量，按供试品中各氨基酸的实际含量，配制6个浓度点的混合对照品溶液；分别精密吸取混合对照品溶液各3 μL，注入液-质联用仪进行测定，以峰面积积分值Y为纵坐标，对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，绘制标准曲线。其回归方程、相关系数（r）、线性范围详见表 2，结果表明18种氨基酸对照品在各自线性范围内线性关系良好。
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表 2 18种氨基酸线性回归方程、相关系数、线性范围及检测限、定量限 Table 2 Regression equation, correlation, linear range, LOD and LOQ of 18 amino acids |
将“2.5”项下最低浓度的混合对照品溶液逐步稀释，在选定的色谱条件下，进样分析，分别以S/N=3和S/N=10确定检测限（LOD）和定量限（LOQ），结果见表 2。
2.7 精密度试验精密吸取“2.5”项下标准曲线中间点的混合对照品溶液3 μL，连续进样6次，测得18种氨基酸峰面积的RSD在0.7%~1.3%之间，结果表明仪器精密度良好。
2.8 重复性试验取同一批样品（批号20150302），按“2.3”项下方法制备6份供试品溶液，依法测定并计算，结果18种氨基酸含量的RSD在0.6%~1.6%之间，表明重复性良好。
2.9 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于配制后的0、4、9、14、19、24 h，精密吸取3 μL，注入液-质联用仪，记录峰面积，18种氨基酸峰面积的RSD在0.5%~1.5%之间，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.10 加样回收率试验精密称取已知含量的同一批号（20150302）样品0.1 g共6份，分别以1:1加入各氨基酸对照品，照“2.3”项下方法制备供试溶液，进行回收率试验，求得加样回收率以考察方法准确度，详见表 3。
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表 3 回收率试验结果（n=6） Table 3 Recoveries |
精密称取9个批次的样品各2份，按“2.3”项下方法制备供试品溶液，分别精密吸取3 μL，按“2.1”项下的色谱及质谱条件进样测定，以标准曲线法定量计算样品含量，结果见表 4。
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表 4 样品含量测定结果（mg·g-1，n=2） Table 4 Results of sample determination |
本文比较了振摇1 h，超声提取20 min以及加热回流提取30 min，结果以超声提取20 min效果较好；考察了超声提取10、20、30 min，结果20 min后已提取完全。
3.2 色谱柱的选择本实验曾采用HILLIC柱进行分析，结果峰形和分离度均较差，故采用普通的C18柱进行试验，18种氨基酸在8 min内全部流出，分析时间短，速度快，质谱难以区分的亮氨酸和异亮氨酸在本系统中达到了基线分离，其余未达到基线分离的氨基酸能通过质谱进行鉴别区分，从而实现定量分析，详见图 1。
3.3 流动相的选择本实验流动相中加入0.1%的甲酸，可抑制氨基酸的解离，增加氨基酸在色谱柱上的保留，改善峰形，提高分离度，同时为氨基酸电离提供质子，增加正离子化信号，提高灵敏度。
3.4 与HPLC法比较本实验也建立了柱前衍生化HPLC法测定猴头菌丝体中18种游离氨基酸的含量，并对9批猴头菌中18种游离氨基酸的含量进行了测定，2种方法所测得结果基本一致，但UPLC-MS/MS法所得结果略高；分析原因可能为柱前衍生化所带来的影响，并且柱前衍生化操作麻烦，费时、费力，HPLC法分析时间也较长，与该法比较，本文所采用方法具有较大优势，不仅样品处理方法简便、快捷，无需衍生化，而且分析时间短，灵敏度高，所测得的结果更加真实可靠，更能反映样品中氨基酸的真实含量。
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