逍遥丸HPLC特征指纹图谱研究及多指标成分定量分析

成分分析

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李海燕. 逍遥丸HPLC特征指纹图谱研究及多指标成分定量分析[J]. 药物分析杂志, 2018, 38(1): 89-96. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.01.11.

LI Hai-yan. Fingerprint and multi-component determination of Xiaoyao pills by HPLC[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2018, 38(1): 89-96. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2018.01.11.

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第一作者

李海燕, Tel:18678620068;E-mail:3511727375@qq.com。

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收稿日期：2017-01-15

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逍遥丸HPLC特征指纹图谱研究及多指标成分定量分析

李海燕

东营市食品药品检验中心, 东营 257091

收稿日期：2017-01-15

第一作者：李海燕, Tel:18678620068;E-mail:3511727375@qq.com

摘要：目的：建立逍遥丸的HPLC指纹图谱，并测定其主要成分（绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯）的量，为逍遥丸的质量控制提供可靠方法。方法：采用C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），以乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~10 min，3% A；10~20 min，3% A→10% A；20~70 min，10% A→80% A），流速1.0 mL·min^-1，检测波长326 nm（0~27 min，绿原酸）、230 nm（27~30.5 min，芍药苷）、280 nm（30.5~36 min，甘草苷、阿魏酸）、276 nm（36~52 min，甘草酸）、350 nm（52~70 min，藁本内酯），柱温35℃；建立逍遥丸HPLC指纹图谱，并对绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯主要成分进行含量测定。结果：在特征图谱研究中，共确定逍遥丸HPLC指纹图谱17个共有峰，通过与混合对照品比较，指认其中6个指标成分分别为绿原酸（4号峰）、芍药苷（6号峰）、甘草苷（8号峰）、阿魏酸（9号峰）、甘草酸（13峰）和藁本内酯（17号峰），利用相似度软件对12批样品指纹图谱进行分析，各批样品相似度均在0.99以上。在建立的色谱条件下试验6个成分分离度良好，方法精密度和重复性RSD均 < 2.0%，供试品溶液在24 h内稳定，各成分具有良好的线性关系和较宽线性范围；12批逍遥丸中绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯含量范围分别为12.254~12.325、10.375~10.449、5.571~5.645、5.066~5.140、2.006~2.080和2.667~2.741 mg·g^-1。结论：所建立的逍遥丸HPLC指纹图谱检测和定量测定分析方法可以有效地评价该制剂的质量。

关键词：逍遥丸多指标成分定量分析绿原酸芍药苷甘草苷阿魏酸甘草酸藁本内酯当归白芍白术甘草茯苓柴胡指纹图谱质量控制

Fingerprint and multi-component determination of Xiaoyao pills by HPLC

LI Hai-yan

Dongying Food and Drug Inspection Center, Dongying 257091, China

Abstract: Objective: To establish HPLC fingerprints of Xiaoyao pills and determine the main components(chlorogenic acid, paeoniflorin, liquiritin, ferulic acid, glycyrrhizic acid and ligustilide), so as to provide reliable method for quality control.Methods: The analysis was carried out on an analytical column C₁₈(4.6 mm×250 mm, 5 μm)with gradient elution of acetonitrile(A)-0.2% phosphoric acid(B)(0-10 min, 3%A; 10-20 min, 3%A→10%A; 20-70 min, 10%A→80%A)at a flow rate of 1.0 mL·min^-1.The detection wavelength was set at 326 nm for chlorogenic acid(0-27 min), at 230 nm for paeoniflorin(27-30.5 min), 280 nm for liquiritin and ferulic acid(30.5-36 min), 276 nm for glycyrrhizic acid(36-52 min)and 350 nm for ligustilide(52-70 min).The column temperature was 35℃.The HPLC fingerprint of Xiaoyao pills was established, and the contents of chlorogenic acid, paeoniflorin, liquiritin, ferulic acid, glycyrrhizic acid and ligustilide were determined.Results: 17 common peaks were found in fingerprints of Xiaoyao pills, 6 of which were identified as chlorogenic acid(peak 4), paeoniflorin(peak 6), liquiritin(peak 8), ferulic acid(peak 9), glycyrrhizic acid(peak 13)and ligustilide(peak 17)by comparison with the reference substances.The similarities of 12 batches of samples were over 0.99.The six compounds were well separated under the chromatographic conditions.The RSD values for precision and repeatability were all less than 2.0% and the test solution was stable in 24 hours.All the compounds had good linearity and wide linear range.The content of chlorogenic acid, paeoniflorin, liquiritin, ferulic acid, glycyrrhizic acid and ligustilide in 12 batches of Xiaoyao pills were 12.254-12.325 mg·g^-1, 10.375-10.449 mg·g^-1, 5.571-5.645 mg·g^-1, 5.066-5.140 mg·g^-1, 2.006-2.080 mg·g^-1 and 2.667-2.741 mg·g^-1, respectively.Conclusion: The established fingerprints and assay methods offered effective evaluation approach for the control of Xiaoyao pills.

Key words: Xiaoyao pills multi-component determination chlorogenic acid paeoniflorin liquiritin ferulic acid glycyrrhizic acid ligustilide Angelicae Sinensis Radix Paeoniae Radix Alba Atractylodis Macrocephalae Rhizoma Glycyrrhizae Radix et Rhizoma Poria Bupleuri Radix fingerprint quality control

逍遥丸（浓缩丸）以柴胡、当归、白芍、炒白术、茯苓、炙甘草、生姜和薄荷共8味药材制得，具有疏肝健脾、养血调经之功效，临床多用于肝郁脾虚所致的郁闷不舒、胸胁胀痛、头晕目眩、食欲减退和月经不调^[1]。逍遥丸是比较常见的中成药，目前，针对其质量分析方面的研究较少，中国药典仅对芍药苷做了技术规定，成英等^[2]也采用HPLC测定逍遥丸中甘草苷、异甘草素和甘草酸的含量，苏兰宜等^[3]对逍遥丸中芍药苷、阿魏酸和槲皮素的含量做了研究，易润青等^[4]采用毛细管电泳法测定逍遥丸中柴胡皂苷a和柴胡皂苷d的含量，白雁等^[5]采用近红外光谱法快速测定逍遥丸中芍药苷的含量，上述研究虽对逍遥丸几个成分做了分析，但不够全面和系统，实用性也不强。

中成药多以几种甚至十几种药材制得，往往是数种药材的活性成分联合发挥作用，单个或部分成分研究无法评价和控制药品质量^[6]。中药指纹图谱质量控制方法能直观、全面和系统地反映出药品内在活性成分，对药品质量做出正确的评价，在中药领域应用广泛，药材和制剂的指纹图谱方法已有报道^[7-13]。本研究建立了逍遥丸HPLC指纹图谱方法，通过与混合对照品图谱比对，从17个共有峰中指认出6个主要成分，并建立同时测定这6个成分含量的方法，方法准确、快速，灵敏度高，实用性强，可以为评价和控制逍遥丸质量提供参考依据。

1 仪器和材料

Waters 2695-2489型高效液相色谱仪（沃特世公司）；Agilent TC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；安捷伦公司）；EP125SM型电子天平（普利赛斯公司）；Thermo Scientific Medifuge台式离心机（赛默飞世尔科技公司）；FP240恒温干燥箱（宾得公司）；SCQ-168数控加热超声波清洗机（上海声彦超声波仪器有限公司，功率3 000 W）；Milli-Q Integral 5超纯水一体化系统（默克密理博公司）。

逍遥丸12批，芜湖张恒春药业有限公司生产，批号分别为1407081（S1）、1411061（S2）、1412131（S3）、1506171（S4）、1509161（S5）、1511031（S6）、1510261（S7）、1603251（S8）、1603261（S9）、1604221（S10）、1605221（S11）、1606121（S12）。

对照品芍药苷（批号110736-201640，含量95.2%）、阿魏酸（批号110773-201313，含量99.6%）、甘草苷（批号111610-201607，含量93.1%）、绿原酸（批号110753-201415，含量96.2%）、甘草酸铵（批号110731-201619，含量93.0%）均购自中国食品药品检定研究院，藁本内酯（批号110825，含量＞98%）购自上海融禾医药科技有限公司；对照药材当归（批号120927-201516，为伞形科植物当归Angelica sinensis（Oliv.）Diels干燥根的粉末）、白芍（批号120905，为毛茛科植物白芍Paeonia lactiflora Pall.的干燥根的粉末）、白术（批号120925-201611，为菊科植物白术Atractylodes macrocephala Koidz.的干燥根茎的粉末）、甘草（批号120904-201519，为豆科植物甘草Glycyrrhiza uralensis Fisch.的干燥根和根茎的粉末）、茯苓[批号121117-201509，为多孔菌科真菌茯苓 Poria cocos（Schw.）Wolf干燥菌核的粉末]、柴胡（批号120992-201509，为伞形科植物柴胡Bupleurum chinense DC.的干燥根的粉末）均购自中国食品药品检定研究院；乙腈（默克公司）为色谱纯，水为超纯水，其余试剂（北京化工厂）均为分析纯。

2 方法与结果 2.1 色谱条件

采用Agilent TC-C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），流动相为乙腈（A）-0.2%磷酸水溶液（B），梯度洗脱（0~10 min，3%A；10~20 min，3%A→10%A；20~70 min，10%A→80%A），流速为1.0 mL·min^-1，进样量20 μL，检测波长为326 nm（0~27 min，绿原酸）、230 nm（27~30.5 min，芍药苷）、280 nm（30.5~36 min，甘草苷、阿魏酸）、276 nm（36~52 min，甘草酸）、350 nm（52~70 min，藁本内酯），柱温35 ℃。

2.2 溶液的制备 2.2.1 混合对照品溶液

分别取绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸、藁本内酯的对照品适量，精密称定，加70%乙醇水溶液制得含绿原酸0.063 mg·mL^-1，芍药苷0.010 mg·mL^-1，甘草苷0.045 mg·mL^-1，阿魏酸0.038 mg·mL^-1，甘草酸0.010 mg·mL^-1和藁本内酯0.021 mg·mL^-1的混合溶液，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.2 供试品溶液

取样品适量，置干燥箱（85 ℃）中干燥60 min。研细，取细粉约1.0 g，精密称定，置200 mL具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇水溶液100 mL，密塞，称量，超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，放冷，再称量，用70%乙醇水溶液补足减失的量，摇匀，0.22 μm微孔滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.2.3 对照药材溶液

取当归、白芍、白术、甘草、茯苓、柴胡的对照药材适量，精密称定，分别按“2.2.2”项下方法同法操作，即得。

2.3 HPLC指纹图谱的建立 2.3.1 精密度试验

取同一批样品（批号1603251）的供试品溶液，连续进样5次，记录色谱图，以甘草酸为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD均小于5%，相对保留时间的RSD均小于2%，表明仪器精密度良好。

2.3.2 稳定性试验

取同一批样品（批号1603251）的供试品溶液，分别在0、3、6、9、12、24 h进样，记录色谱图，以甘草酸为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD均小于4%，相对保留时间的RSD均小于2%，结果表明供试品溶液在24 h内稳定。

2.3.3 重复性试验

取同一批样品（批号1603251）6份，按“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录色谱图，以甘草酸为参比峰，计算各共有峰相对峰面积的RSD均小于5%，相对保留时间的RSD均小于2%，结果表明方法重复性良好。

2.3.4 指纹图谱的建立及相似度评价

取逍遥丸（浓缩丸）12批（S1~S12），按照“2.2.2”项下方法制备供试品溶液，依“2.1”项下色谱条件进行测定，指纹图谱采用国家药典委员会推荐的《中药色谱指纹图谱相似度评价系统》（2012年版）进行分析，以S1为参考图谱，时间窗宽度设为0.3 min，经全谱匹配共确立17个共有峰，并生成指纹图谱共有模式（平均值法，R）。结果12批供试品相对于共有模式的相似度分别为0.998、0.996、0.993、0.975、0.999、0.995、0.996、0.994、0.990、0.992、0.997、0.995，均大于0.99，说明逍遥丸各批次之间质地均匀。在17个共有峰中，以13号峰的峰面积适中，与相邻峰之间分离完全，对称性较好，故确定13号峰为参照峰（S）。指纹图谱及其共有模式见图 1，共有峰相对峰面积见表 1。

图 1 12批逍遥丸HPLC指纹图谱和对照指纹图谱 Figure 1 Fingerprints of 12 batches of Xiaoyao pills and the reference fingerprint

表 1 12批样品（S1~S12）共有峰相对峰面积 Table 1 The relative areas of common peaks of 12 samples(S1-S12)

峰号（peak No.）	相对峰面积（relative area）
峰号（peak No.）	S1	S2	S3	S4	S5	S6	S7	S8	S9	S10	S11	S12
1	1.413	1.412	1.386	1.413	1.418	1.411	1.410	1.423	1.397	1.384	1.384	1.380
2	0.072	0.093	0.074	0.076	0.073	0.049	0.068	0.072	0.071	0.074	0.074	0.063
3	0.070	0.095	0.064	0.069	0.077	0.068	0.084	0.119	0.064	0.082	0.082	0.082
4	0.183	0.178	0.166	0.163	0.171	0.168	0.166	0.164	0.164	0.164	0.164	0.184
5	0.161	0.167	0.165	0.149	0.159	0.134	0.149	0.165	0.158	0.148	0.148	0.127
6	4.285	4.425	4.328	4.164	4.267	4.201	4.258	4.318	4.205	4.375	4.375	4.239
7	0.255	0.249	0.259	0.249	0.256	0.263	0.249	0.257	0.254	0.253	0.253	0.259
8	0.348	0.344	0.350	0.342	0.350	0.326	0.332	0.347	0.349	0.348	0.348	0.350
9	0.573	0.596	0.597	0.600	0.563	0.598	0.592	0.601	0.570	0.602	0.602	0.611
10	0.287	0.204	0.348	0.286	0.348	0.275	0.191	0.193	0.288	0.348	0.348	0.289
11	0.079	0.081	0.082	0.081	0.080	0.081	0.081	0.081	0.082	0.081	0.081	0.081
12	0.120	0.117	0.116	0.117	0.117	0.117	0.117	0.117	0.119	0.116	0.116	0.117
13（S）	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000	1.000
14	0.347	0.344	0.344	0.344	0.347	0.346	0.347	0.347	0.346	0.343	0.343	0.349
15	0.110	0.111	0.108	0.107	0.107	0.107	0.107	0.107	0.108	0.107	0.107	0.107
16	0.109	0.108	0.108	0.108	0.108	0.107	0.108	0.108	0.109	0.110	0.110	0.110
17	0.415	0.411	0.398	0.399	0.414	0.399	0.398	0.400	0.409	0.410	0.410	0.410

表 1 12批样品（S1~S12）共有峰相对峰面积 Table 1 The relative areas of common peaks of 12 samples(S1-S12)

2.3.5 色谱峰的指认

取空白溶剂、混合对照品溶液、供试品溶液及对照药材溶液，按“2.1”项下色谱条件依次进样测定。空白溶剂、对照品、样品和对照药材色谱图见图 2。17个共有峰经与混合对照品和对照药材色谱峰比对分析，可以指认出：峰9、16、17来源于当归，峰1、6、9来源于白芍，峰2、3、9号峰来

4.绿原酸（chlorogenic acid）6.芍药苷（paeoniflorin）8.甘草苷（liquiritin）9.阿魏酸（ferulic acid）13.甘草酸（glycyrrhizic acid）17.藁本内酯（ligustilide）
A.空白溶剂（solvent blank）B.混合对照品（mixed reference substances）C.样品（sample）D.当归药材（Angelicae Sinensis Radix）E.白芍药材（Paeoniae Radix Alba）F.白术药材（Atractylodis Macrocephalae Rhizoma）G.甘草药材（Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）H.茯苓药材（Poria）I.柴胡药材（Bupleuri Radix）图 2 空白溶剂、混合对照品、样品和对照药材的HPLC图 Figure 2 HPLC chromatograms of solvent blank, mixed reference substances, sample and reference crude drugs

源于白术，峰8、11、12、13、14、15来源于甘草，4号峰为当归、白术和茯苓共同贡献，5号峰为当归、白芍、白术和甘草共同所有，而7号峰来自于白术和甘草，10号峰来自于当归和甘草；可以确定的化合物有：4号峰为绿原酸，6号峰为芍药苷，8号峰为甘草苷，9号峰为阿魏酸，13号峰为甘草酸，17号峰为藁本内酯。

2.4 逍遥丸中多指标成分定量分析 2.4.1 线性关系的考察

分别精密量取混合对照品溶液2、6、12、24、36、48 μL注入液相色谱仪，按“2.1”项下色谱条件进行分析，记录液相色谱图。以各组分色谱峰峰面积（Y）为纵坐标，进样量（X）为横坐标，绘制标准曲线，求得各组分回归方程及相关系数见表 2。

表 2 峰面积与浓度的线性关系

2.4.2 仪器精密度试验

取同一批样品（批号1603251）的供试品溶液，在“2.1”项色谱条件下，连续进样6次，记录色谱图。结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯峰面积的RSD分别为0.26%、0.56%、0.84%、0.79%、0.61%和0.90%，表明仪器精密度良好。

2.4.3 稳定性试验

取同一批样品（批号1603251）的供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件，分别于0、4、8、12、18、20、24 h进样，记录色谱图。结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯峰面积的RSD分别为1.6%、1.8%、1.6%、1.1%、0.78%和1.0%，表明在24 h内供试品溶液稳定。

2.4.4 重复性试验

取同一批样品（批号1603251），按“2.2.2”项方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进行测定，记录色谱图。结果绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯含量分别为12.365、10.387、5.580、5.079、2.016、2.676 mg·g^-1，RSD分别为0.98%、1.1%、1.1%、0.78%、0.84%和0.57%，表明本方法重复性良好。

2.4.5 加样回收率试验

取同一批样品（批号1603251）干燥细粉0.5 g共6份，精密称定，分别置200 mL具塞锥形瓶中，加入绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯对照品各适量，按“2.2.2”项下方法制备供试溶液，进样分析，记录色谱图，计算各组分加样回收率，结果见表 3。

表 3 逍遥丸6种成分的加样回收率结果（n=6） Table 3 Recoveries of six components in Xiaoyao pills

化合物（compound）	样品含量（original）/mg	对照品加入量（spiked）/mg	测得总量（found）/mg	回收率（recovery）/%	平均回收率（average recovery）/%	RSD/ %
绿原酸（chlorogenic acid）	6.153	6.141	12.283	99.91	99.5	0.47
	6.137	6.167	12.278	99.79
	6.124	6.136	12.127	98.92
	6.104	6.110	12.112	99.17
	6.213	6.195	12.399	99.94
	6.168	6.220	12.266	99.02
芍药苷（paeoniflorin）	5.216	5.204	10.109	97.02	99.1	2.0
	5.113	5.220	10.559	102.19
	5.128	5.141	10.237	99.69
	5.268	5.115	10.338	99.56
	5.165	5.147	9.993	96.92
	5.186	5.172	10.296	99.40
甘草苷（liquiritin）	2.315	2.302	4.728	102.40	100.6	1.4
	2.258	2.328	4.560	99.43
	2.247	2.259	4.608	102.27
	2.302	2.233	4.525	99.78
	2.255	2.237	4.483	99.82
	2.249	2.262	4.499	99.73
阿魏酸（ferulic acid）	2.561	2.549	4.999	97.83	98.0	0.93
	2.501	2.575	4.950	97.52
	2.530	2.543	4.940	97.39
	2.532	2.517	4.946	97.98
	2.540	2.522	5.055	99.84
	2.503	2.547	4.929	97.59
甘草酸（glycyrrhizic acid）	1.031	1.019	2.039	99.46	99.8	0.81
	1.056	1.045	2.127	101.24
	1.021	1.034	2.052	99.84
	1.032	1.008	2.024	99.21
	1.053	1.035	2.089	100.00
	1.035	1.060	2.073	98.96
藁本内酯（ligustilide）	1.365	1.352	2.706	99.60	99.7	0.75
	1.381	1.378	2.785	100.94
	1.348	1.361	2.677	98.81
	1.345	1.335	2.663	99.40
	1.346	1.328	2.675	100.00
	1.348	1.353	2.680	99.19

表 3 逍遥丸6种成分的加样回收率结果（n=6） Table 3 Recoveries of six components in Xiaoyao pills

2.4.6 样品定量测定

取逍遥丸供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件测定，按外标法分别计算样品中绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯的含量，结果见表 4。

表 4 样品测定结果（mg·g^-1，n=3） Table 4 Determination results

3 讨论 3.1 提取方式的选择

研究发现，将逍遥丸预先干燥60 min后，再进行溶液制备，分析所得到色谱图基线噪音较小，色谱信息也较未处理时丰富，峰形和强度也有明显改善和增加，本研究中，样品在制备溶液前均经干燥处理。用甲醇制备样品的溶液时，色谱峰较少，而改用70%乙醇水溶液后，经超声处理（功率250 W，频率33 kHz）30 min，色谱峰较多，各成分也能提取完全。

3.2 色谱条件优化

逍遥丸由8味药材制得，成分复杂，各成分化学结构存在差异，分析波长也不尽相同，通过查阅相关文献^{[2, 14-15]}，设定检测波长为326 nm（绿原酸）、230 nm（芍药苷）、280 nm（甘草苷、阿魏酸）、276 nm（甘草酸）和350 nm（藁本内酯），利用色谱仪波长变换功能分段实施。在流动相考察方面，先后对甲醇-水系统、甲醇-磷酸盐水系统、乙腈-冰醋酸水系统及乙腈-磷酸盐水系统进行比较，结果以乙腈-0.2%磷酸水溶液系统试验得到色谱峰信号较多，各峰之间分离较好，峰形较佳；而等度洗脱出峰时间过长，在不影响分离度前提下，采用梯度洗脱程序更为合理和经济；柱温对分离度有一定影响，笔者先后考察20、25、30、35、40 ℃等系列柱温，发现当柱温小于35 ℃时，供试品色谱图中存在峰包裹情况，尤其是7、8和9号峰之间难以分离，而当柱温高于35 ℃时各峰分离完全，考虑色谱柱使用寿命，故不考虑以40 ℃作为实验柱温条件。

本研究利用HPLC法，在同一色谱条件下，既建立了逍遥丸指纹图谱，又同时测定了绿原酸、芍药苷、甘草苷、阿魏酸、甘草酸和藁本内酯共6个成分的含量，方法简便快捷，科学实用，同时具备定性和定量两重作用，为有效控制逍遥丸质量提供了科学依据。

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