纳米材料凭借其独特的小尺寸效应、表面效应、量子尺寸效应和宏观量子隧道效应等理化特性优势，应用范围涉及生活的方方面面。以医学为例，纳米材料在诸如生物传感、医疗诊断、造影成像、药物运输等临床领域使用已有数年历史^[1]。纳米银（silver nanoparticles，AgNPs）及其氧化物是目前应用最为广泛的医药用纳米材料^[2]。借助其广谱抗菌性，临床上含AgNPs的材料可用作伤口敷料、心血管埋植剂、医用导管和药物载体^[3]。近年来新型纳米材料层出不穷，常见的有氧化锌纳米颗粒（zinc oxide nanoparticles，ZnONPs）、氧化铜纳米颗粒（copper oxide nanoparticles，CuONPs）、氧化铁纳米颗粒（iron oxide magnetic nanoparticles，IONPs）、量子点（quantum dots，QD）等。其中超顺磁性氧化铁纳米颗粒（superparamagnetic iron oxide nanoparticles，SPION）作为新型纳米材料造影剂，得益于在体内示踪和对体内网状系统的特异性方面的突出表现，一经发现就成为研究的热点。

随着金属离子的引入，纳米材料的遗传毒性也成为人们关注的热点。纳米材料的遗传毒性，已发展为专门的分支研究领域—纳米遗传毒理学（nanogenotoxicology）。研究^[4-7]发现，纳米材料在细胞、亚细胞、分子生物学水平如基因和蛋白水平等具有一定的细胞毒性和遗传毒性效应。而应用于医疗器械和造影剂领域的纳米材料（如AgNPs、IONPs、ZnNPs等）所携带的金属离子，在进入体内后可能通过体内长期蓄积诱导氧化应激等进一步诱发染色体或DNA断裂^[4]。此外，纳米药物具有缓释特性，可在循环系统中长期存在。因此有必要通过遗传毒性检测方法对其潜在致癌和致畸作用进行评估。

目前应用最广泛、研究最透彻的医用纳米材料是AgNPs和IONPs。本文将以此为例，对其遗传毒性研究作一综述，同时从纳米颗粒的特性如尺寸、形状、表面修饰等角度来讨论影响毒性效应的因素。

1 纳米材料诱发的遗传毒性 1.1 遗传毒性评价方法的选择

探究遗传毒性时，通常借助经典的遗传毒性试验方法，如Ames试验、微核试验、彗星试验和染色体畸变试验等。然而，因细菌缺乏颗粒内吞的能力^[4]，对致癌性结果预测率高的Ames试验并不适用于纳米材料的遗传毒性评价。选择适合的方法是正确评价纳米材料遗传毒性的前提。

目前纳米材料的遗传毒性评价主要借助于微核试验和彗星试验^[8]，这2种方法操作简便，灵敏度高，检测终点不同，为纳米材料的遗传毒性评价提供重要理论依据。微核试验除了常规微核试验，还包括改良版的细胞分裂阻滞微核分析法、荧光原位杂交试验和DNA探针与抗着丝粒抗体染色等方法，尤其后者的广泛应用，为阐明毒性机理提供了重要的理论支撑^[9]。国际遗传毒性检测程序工作会议提出将流式运用到微核试验中，提高了统计学意义和灵敏度^[10-11]。彗星试验能够直接检测受试物对靶细胞DNA的损伤，具有灵敏度高的优点，但高灵敏度也造成了假阳性率的升高。Karlsson等^[12]比较了66种纳米材料的微核试验和彗星试验的结果，一致率仅为69%，因此目前纳米材料的遗传毒性评价需要综合评估微核试验和彗星试验的结果。而且随着高通量筛选在彗星试验中的应用与完善^[13-15]，弥补了以往存在的样本量有限及人工计数耗时耗力等不足，Azqueta^[16]比较了传统彗星试验和高通量彗星试验，发现两者的结果基本一致。

另外，文献[17-18]中也有使用小鼠淋巴瘤细胞tk^+/-位点突变试验、细胞分裂中期染色体畸变试验和Balb/c 3T3细胞体外转化试验来评价纳米材料的遗传毒性。欧洲食品安全局（European Food Safety Authority，EFSA）发布的关于用于食品和饲料的纳米材料安全性评估方法指导原则（Opinion on the Potential Risks Arising from Nanotechnologies on Food and Feed Safety）^[19]也提出，在遗传毒性评价方面，需首先完成小鼠淋巴瘤细胞TK基因突变试验（MLA，需对克隆大小进行分类）和体外微核试验。上述2项遗传毒性研究中如其中一项为阳性结果，或两者均为阴性结果，但有数据显示受试物可产生活性氧簇（reactive oxygen species，ROS），或受试物无法用于体外研究（如溶解性较差的颗粒），则需继续开展体内遗传毒性研究，如体内微核试验、体内彗星试验或转基因啮齿动物基因突变试验。其中基于骨髓细胞和肝细胞的体内遗传毒性试验为最佳选择。而以DNA断裂为检测终点的彗星试验是评价纳米材料遗传毒性的重要手段。

1.2 纳米材料主要遗传毒性表现形式

纳米材料诱发的遗传毒性主要表现为DNA断裂与染色体损伤。有文献^[17]通过微核试验发现，20~100 nm的被聚乙烯吡咯烷酮（polyvinyl pyrrolidone，PVP）和柠檬酸盐包被的AgNPs可诱发L5178Y细胞和TK6细胞微核率的升高，且其程度与粒径和表面修饰有关，20 nm包被柠檬酸盐的AgNPs诱发微核的数量最多。Asharani等^[20]通过彗星试验检测到AgNPs可以导致DNA断裂和染色体突变，Ahamed^[21]通过免疫印迹试验发现AgNPs可诱导DNA损伤修复蛋白Rad 51的过表达。此外，IONPs能够导致人肺腺癌A549细胞DNA氧化损伤和微核的产生^[22-23]，鼠李糖包被的氧化铁纳米颗粒（rhamnose-coated superparamagnetic iron-oxide nanoparticle）在高浓度时彗星试验结果呈阳性^[24]。KM小鼠连续7 d静脉注射IONPs后，高剂量组（20、40 mg·kg^-1）动物的肝脏和肾脏中发现DNA受损标志物—8-羟脱氧鸟苷（8-OHdG）水平显著升高^[25]。

但也有大量试验并未检测到纳米材料的遗传毒性。如Remya^[26]选择粒径小于25 nm的葡聚糖包被的IONPs为研究对象单次灌胃大鼠，在肝组织中并未检测到8-OHdG的升高，50~100 mg·kg^-1单次静脉给药小鼠并分离骨髓细胞进行检测，结果染色体畸变率与对照组无差别^[27]。造成这种差别的原因可能与试验所用的IONPs种类有关。可见纳米材料的特性影响了遗传毒性检测结果，这也是已发表的研究结果之间类比性较低的原因之一。

除直接作用于遗传物质外，纳米材料另一个普遍的效应是诱导细胞周期紊乱。正常的有丝分裂是确保遗传物质稳定的重要环节，而细胞中的纳米颗粒可以直接或间接地损害有丝分裂相关亚细胞器，改变细胞周期检查点活性，进而干扰细胞分裂导致染色体结构或数量异常^[5]。Ahamed等^[21]报道了AgNPs引起鼠胚胎成纤维细胞和干细胞的细胞周期检查点蛋白质p53上调。IONPs可导致人间充质干细胞G₀-G₁期的细胞比例明显下降^[28]，其潜在机制可能与IONPs改变了细胞周期调节蛋白的表达水平有关，例如细胞周期素依赖性激酶和细胞周期负性调节蛋白^[29]。纳米材料还可以通过影响细胞微丝、微管结构的稳定性来干预有丝分裂的正常进行，并表现为致细胞多核作用甚至引起凋亡。

2 纳米材料的遗传毒性机制

纳米颗粒引起遗传毒性效应的完整机制尚无定论，但目前国内外主要研究观点集中于纳米颗粒与遗传物质的直接作用和ROS的生成两方面。

2.1 直接作用于遗传物质

纳米颗粒粒径范围在10~100 nm之间，能够通过扩散、穿越核孔复合体和在细胞有丝分裂或减数分裂过程中被核膜包裹3种途径进入细胞核^[5]，直接作用于DNA，导致DNA降解、DNA链断裂、基因突变等。另外释放到细胞中的金属阳离子常以表面负电荷的DNA分子为靶标，如IONPs能够释放出游离的铁离子，与表面负电荷的DNA分子结合，引起可逆或不可逆的DNA损伤，产生遗传毒性效应^[29]。

2.2 促进活性氧的生成

纳米材料还可以通过诱导ROS水平的升高导致遗传物质间接性损伤。ROS引起的DNA损伤主要包括单链或双链DNA断裂，碱基与糖链的改变，基因变异、缺失、移位等，8-OHdG的形成就是DNA受到氧化损伤的标志之一^[30]，磁性氧化铁纳米颗粒作用于A549细胞能引起8-OHdG水平的显著升高^[31]。Neenu等^[32]研究发现，γ-Fe₂O₃ dUSPION（dextran-coated USPION）可升高MCL5细胞中ROS的水平，从而导致染色体损伤和微核的增多；而当可以清除ROS的N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）与γ-Fe₂O₃ dUSPION共孵育时，MCL5细胞中微核出现率显著性降低。与IONPs类似，使用10 mmol·L^-1 NAC前处理人肝癌细胞，可以降低AgNPs诱导的ROS水平，提高细胞活性并减少DNA损伤^[33]。

此外，IONPs能够释放出大量的铁离子，并通过Fenton反应^{[30, 34]}产生大量的·OH自由基：

2O^·2^-+2H⁺→H₂O₂+O₂（dismutase reaction）

Fe²⁺+H₂O₂→Fe³⁺+·OH+OH^-（Fenton reaction）

大量·OH会导致染色质中胸腺嘧啶与酪氨酸的交联，还能引起嘌呤和嘧啶分子的改变^[34]，释放的铁离子还能破坏机体内铁元素总量的平衡，过量的铁离子会对机体造成严重的损伤，包括引起DNA合成的紊乱、线粒体氧化磷酸化和影响氧气运输、细胞色素P450的功能^[35]等。

ROS的形成与纳米颗粒的表面效应有关，且ROS的严重程度与粒径成反比，粒径越小，生成的ROS越多^[36-37]。ROS能够激活一些特殊的信号通路，例如MAPK和NF-kB通路^[38]，随着具有拮抗氧化作用的物质如超氧化物歧化酶（superoxide dismutase，SOD）的消耗，促进促炎因子的释放^[39]，从而引发炎症反应，进一步加重氧化应激，形成恶性循环。此外纳米颗粒引起的线粒体膜电势下降、内质网和高尔基体应激都与胞内ROS的累积有关^[40]。

当DNA产生损伤时，细胞会做出一系列的反应进行调整，如细胞循环周期停止，启动凋亡程序或者DNA修复程序等^[4]。已有报道^[2]称当细胞暴露于纳米颗粒时，一些与DNA修复有关的蛋白表达会受到影响。此外，金属氧化物释放的金属离子会影响DNA修复酶与DNA修复位点的亲和力。DNA修复程序对细胞保持其遗传完整性和细胞活性至关重要，如果修复程序不能及时修复错误的DNA，可能会造成诱变甚至癌变的严重后果。

3 影响纳米材料遗传毒性大小的因素

越来越多的研究提示纳米材料的理化性质对其胞内摄入和后续的生理反应有着至关重要的作用。

3.1 尺寸、形状和表面积

粒径小是纳米材料最显著的特点之一，同样也是其研究价值所在，但也为机体带来不容忽视的安全隐患。纳米材料的小粒径，使其能够更加轻易地进入细胞，与胞内物质相作用。有研究^[41-44]使用14~500 nm范围内的各种粒径的纳米颗粒验证其被细胞摄入的能力，发现50 nm的颗粒其摄入速度和程度最大。吸入试验^[4]也表明，同物质纳米级比微米级更易在肺内沉积，从而引起更严重的炎症反应。体外试验^[31]也提示不同大小的氧化铁纳米颗粒作用于A549细胞24 h后，20~60 nm的磁性纳米颗粒（magnetite nanoparticles，MNP）的摄入速度明显大于微米级的磁性颗粒。相同浓度下纳米级别的氧化铁或氧化钛纳米颗粒比微米级别的颗粒更易造成胞内ROS的升高^[45]。颗粒的性状也是影响其入胞速度的因素之一，研究发现球状颗粒的摄入速度显著高于棒状纳米颗粒，高宽深比例大的颗粒更易进入胞内，Mahmoudi等^[7]研究结果表明纳米颗粒的形状对细胞毒性有直接的影响，SPION的细胞毒性由大到小依次为球状、表面粗糙的杆状、粒径随机分布的聚合粉。随着粒径的减小，纳米颗粒整体的表面积远高于同浓度的微米级颗粒，纳米颗粒表面的原子处于活泼状态，为了达到稳定状态，更易于和周围物质发生反应，造成细胞损伤和加重氧化应激^[4]。

3.2 表面修饰

纳米材料的表面修饰通常是指通过共价键或者化学反应等手段在表面覆上一层封端剂（capping agent），主要目的是防止颗粒聚集，增加水溶性或者实现靶向给药^[46]。常用的封端剂包括水溶性聚合物、寡糖和多糖等，例如聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）、葡萄聚糖等。涂层可以阻断纳米颗粒与细胞的直接接触，从而减轻毒性。Auffan等^[47]发现Fe₂O₃纳米颗粒经二巯基丁二酸（meso-2，3-dimercaptosuccinic acid，DMSA）包被后，遗传毒性显著减弱。IONPs经PEG包被后，巨噬细胞非特异性摄取的能力变弱，从而降低了引发炎症的风险，减少了ROS的生成^[48]。另一方面，包被的纳米颗粒与抗体、肽链、激素等复杂的大分子亲和力增加，因此对机体的稳态产生潜在影响。包被溴化十六烷基吡啶（bromohexadecyl pyridine，CPB）的AgNPs更容易与DNA接触，从而造成遗传物质损伤^[49]。使用25 nm多聚糖包被AgNPs和未包被AgNPs对鼠胚胎干细胞和鼠胚胎纤维母细胞染毒，结果显示多聚糖包被的AgNPs比未包被AgNPs表现出更大的毒性^[11]。杨鹏飞等^[50]比较了PEG、牛血清蛋白（BSA）以及羧基（-COOH）3种不同表面修饰的IONPs对大鼠的毒性作用，结果显示BSA-IONPs在器官中的清除率较PEG-IONPs和COOH-IONPs更快，在血液中的半衰期更长，而COOH-IONPs更易引起细胞的凋亡。Seong等^[51]借助彗星试验比较了未经修饰的磁性氧化铁纳米颗粒与羟基（-OH）、羧基（-COOH）、胺基（-NH₂）3种不同功能团修饰的磁性氧化铁纳米颗粒的遗传毒性，结果显示胺基修饰的磁性氧化铁纳米颗粒对DNA造成的损害要远远高于其他3种纳米材料，造成这种差异的主要原因是经胺基修饰后，颗粒表面带正电荷，更易与表面带负电荷的DNA相互作用。以上研究均提示表面修饰对纳米颗粒的毒性有影响，且与表面修饰的类型有关。

除纳米材料自身的理化性质能够影响遗传毒性外，外界因素例如pH、温度等因素均会影响纳米颗粒聚集，进而影响毒性效应，因此在药物设计时要充分考虑各方面因素。

4 小结与展望

医用和药用纳米材料应用前景广阔，伴随而来的是纳米材料机体暴露机会的大幅度增加，其毒性也因此逐渐成为学界关注焦点。本文集中论述了常见医用和药用纳米材料的遗传毒性及机制，并根据其理化性质的特殊性对潜在毒性作用进行探讨。然而，纳米材料的具体遗传毒性的机制还不甚明朗，且主要集中在细胞水平，今后的相关研究应着重关注分子水平研究。此外，当前不同研究使用的纳米材料的理化性质和细胞模型不尽相同，为毒性结果转化和毒性预测带来了困难。鉴于纳米材料特殊的分靶器官分布特征、蓄积性和缓释效应，目前现有美国FDA和经济合作与发展组织（organization for economic co-operation and development，OECD）的遗传毒性评价方法可能无法有效而可靠地进行评价。针对纳米材料特性来建立适宜的纳米材料评价体系，从而推动医用纳米材料的深入开发与应用是迫在眉睫的任务。