2018, Vol. 38 
2. 皖西学院生物与制药工程学院, 六安 237000
2. College of Biological and Pharmaceutical Engineering, West Anhui University, Lu'an 237000, China
铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）为兰科多年生草本植物。其茎入药，有滋阴益胃、清热生津、益智安神、强精壮骨之功效，位列“中华九大仙草”之首[1-2]。现代药理实验表明，功能性多糖（非淀粉多糖）为铁皮石斛主要活性成分之一[3-4]，具有抗癌[5]、调节免疫[4, 6]、抗氧化[7]等作用。功能性多糖活性与其理化特征如分子质量、构型、单糖组成和糖苷键连接类型等密切相关[8-9]，而不同来源铁皮石斛功能性多糖结构特征比较研究尚未见报道。本文采用高效凝胶色谱联用多角度激光散射和示差折光仪法（HPSEC-MALLS-RID）测定不同产地铁皮石斛多糖重均相对分子质量、回旋半径及含量，气相色谱联用质谱法（GC-MS）分析铁皮石斛多糖的单糖组成及糖苷键，以及基于荧光辅助凝胶电泳（PACE）、薄层色谱（TLC）-糖谱法分析铁皮石斛功能性多糖部分酸水解和酶解产物特征，为其质量控制奠定基础。
1 仪器与试药Multiwave 3000微波辅助提取仪（安东帕公司）、PowerPac HV电泳仪（伯乐公司）、InGenius LHR凝胶成像系统（Syngene公司）、DAWN HELEOS-II多角度激光光散射仪和Optilab T-rEX示差检测器（怀亚特公司）、Agilent 1100高效液相色谱仪（安捷伦科技公司），色谱柱TSK Gel G5000PWXL（300 mm×7.8 mm，10 μm；填料：甲基丙烯酸酯；东曹公司）和TSK Gel G3000PWXL（300 mm×7.8 mm，7 μm；填料：甲基丙烯酸酯；东曹公司），Agilent 19091S-433 HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm；涂层：（5%-苯基）-甲基聚硅氧烷；安捷伦科技公司）。
葡萄糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖、海藻糖、半乳糖醛酸、甘露糖、纤维素酶（EC 3.2.1.4）、α-淀粉酶（EC 3.2.1.4）、淀粉的对照品和硼酸（99.8%）、硼氢化钠（98.5%）、吡啶（99.8%）、乙酸酐（99.5%）来自于Sigma公司；羧甲基纤维素、昆布二糖至五糖（95%）、β-1，4-甘露聚糖酶（EC 3.2.1.78）和魔芋葡甘聚糖来自于Megazyme公司；无水级二甲基亚砜，分析级三氟乙酸、氢氧化铵、醋酸、苯胺、二苯胺购买于上海阿拉丁公司；色谱级甲醇购买于默克公司；Tris（99.8%）购买于Bio-Rad公司；分析级正丁醇、异丙醇、二氯甲烷购买于天津市富宇精细化工有限公司。
铁皮石斛样品（样品号DF01~DF18）共18批，分别来自安徽霍山（样品号DF01~DF05、DF08、DF09）、安徽金寨（样品号DF10）、浙江（样品号DF06）、云南（样品号DF07）、福建（样品号DF14-DF18）以及3个分别来自安徽霍山（样品号DF11）、浙江（样品号DF12）和云南（样品号DF13）的铁皮石斛加工品（枫斗）。所有样品经安徽皖西学院陈乃富教授鉴定确认为铁皮石斛Dendrobium officinale Kimura et Migo，备份样品保存于澳门大学中药质量研究国家重点实验室。
2 方法与结果 2.1 铁皮石斛功能性多糖制备称取药材粉末（40目）1.0 g，以80%甲醇水于100 ℃回流提取1.0 h，除去药材中小分子化合物；残渣加水60 mL，微波辅助提取法提取[10]：微波功率为800 W，温度100 ℃，提取时间9.0 min。提取物离心取上清液，加入4倍体积无水乙醇，置4 ℃冰箱过夜，离心（4 500 g，15 min）收集沉淀，多糖沉淀再用15.0 mL去离子水复溶，离心（4 500 g，15 min）弃不溶物；多糖上清液加入α-淀粉酶（至酶浓度20 U·mL-1），酶解24 h，并以碘-碘化钾法（取酶解液100 μL，加入0.1 mol·L-1的碘-碘化钾溶液10 μL）确定淀粉是否完全酶解，完全酶解物离心超滤（膜截留分子量3 000 Da）除去小分子化合物，收集上清液，冻干即得功能性多糖。
图 1为铁皮石斛多糖酶解前后碘-碘化钾显色和HPSEC分析结果。铁皮石斛多糖酶解前碘-碘化钾显色呈蓝色，说明其中含有淀粉。酶解24 h后，蓝色消失，说明淀粉已被降解。HPSEC分析结果进一步证实了淀粉被酶解为小分子糖类化合物。
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DF16.福建产铁皮石斛DF16样品多糖（polysaccharides from sample DF16）DF16+E.福建产铁皮石斛DF16样品多糖+α-淀粉酶（polysaccharides from sample DF16+ α-amylase） 图 1 铁皮石斛α-淀粉酶酶解前后碘-碘化钾显色和HPSEC图谱 Figure 1 I2-KI colorimetric assay and HPSEC chromatogram of polysaccharide from D. officinale before and after α-amylase digestion |
参照文献报道方法[11]进行HPSEC-MALLS-RID分析，基于比折光指数增量值测定铁皮石斛功能性多糖的含量、重均相对分子质量、回旋半径和多分散系数。采用TSK-GEL G5000 PWXL串联TSK Gel G3000PWXL色谱柱，柱温35 ℃；流动相为9 mg·mL-1氯化钠水溶液，流速0.5 mL·min-1；供试品溶液（功能性多糖样品3.0 mg，溶于1 mL去离子水）经0.45 μm滤膜过滤后进样100 μL测定；采用Astra 6软件收集及处理数据。
HPSEC-MALLS-RID分析结果见表 1，HPSEC-RID结合UV检测色谱图见图 2。结果表明：不同产地铁皮石斛功能性多糖HPSEC图谱基本一致，在280 nm处未见明显紫外吸收，可见铁皮石斛多糖基本不含蛋白质。不同样品多糖重均相对分子质量（Mw）在0.533×105~4.575×105之间，Rg为19.8~71.7 nm，多分散系数（Mw/Mn）为1.34~2.82。不同产地铁皮石斛功能性多糖含量均较高，为6.28%~28.72%，差异悬殊，可能与产地和栽培条件有关。
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表 1 不同产地铁皮石斛功能性多糖含量和分子参数 Table 1 The contents and molecular parameters of specific polysaccharide in D. officinale |
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DF01，DF07，DF12和DF18分别为产地安徽、云南、浙江和福建的铁皮石斛 DF01，DF07，DF12 and DF18 were D. officinale from Anhui，Yunnan，Zhejiang and Fujian，respectively 图 2 铁皮石斛功能性多糖代表性HPSEC图谱 Figure 2 HPSEC chromatograms of specific polysaccharide from D. officinale |
称取功能性多糖3.0 mg，加入2.0 mol·L-1三氟乙酸溶液1.0 mL溶解，于功率500 W及温度100 ℃条件下微波辅助酸水解4 min，冷却后于氮吹仪吹干，即得酸水解产物；参照文献衍生化后GC-MS法测定单糖组成[12]，即酸水解产物中加入0.5 mL吡啶（含10.0 mg盐酸羟胺），于90 ℃反应30 min，再加入0.5 mL乙酸酐90 ℃反应30 min，氮气吹干，用1 mL甲醇溶解，即得供试品溶液。GC-MS分析采用Agilent 19091S-433 HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样量2 μL，程序升温（起始温度165 ℃，保持7 min，以5 ℃·min-1升温至185 ℃，保持5 min，以4 ℃·min-1升温至200 ℃，以20 ℃·min-1升至280 ℃）。
铁皮石斛功能性多糖甲基化采用微波辅助法[12]，功能性多糖样品5 mg，加入无水二甲基亚砜1 mL，充分溶解，随后加入氢氧化钠约20 mg，置于常温超声溶解10 min；再加入碘甲烷100 μL，利用微波辅助甲基化，微波功率为200 W，反应时间4 min，冷却后加水1 mL终止反应，透析管透析（分子量截留3 500 Da），冻干，加入2 mol·L-1三氟乙酸水溶液1 mL，封管，微波辅助水解（500 W，4 min），反应结束后，氮吹干燥；加入2 mol·L-1氢氧化铵溶液（含有1 mol·L-1硼氢化钠）1 mL还原，置于常温搅拌1 h；加入乙酸50 μL终止反应，氮吹干燥，重复加入甲醇200 μL和乙酸5 μL干燥2次，最后加入甲醇200 μL干燥；加入吡啶0.5 mL和乙酸酐0.5 mL进行乙酰化反应，90 ℃反应30 min。反应后加水1 mL和二氯甲烷1 mL萃取2次，收集二氯甲烷层，氮吹干燥，加入甲醇1 mL复溶，即得供试品溶液。GC-MS分析采用Agilent 19091S-433 HP-5MS毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），进样量2 μL，程序升温（起始温度120 ℃，以5 ℃·min-1升温至200 ℃，以8 ℃·min-1升温至250 ℃，以20 ℃·min-1升至280 ℃）。
不同产地铁皮石斛功能性多糖GC-MS图谱相似，其单糖组成主要为甘露糖、葡萄糖以及少量半乳糖；根据文献报道[3, 13]，其甘露糖部分发生乙酰化。除DF13铁皮石斛枫斗样品外，不同铁皮石斛功能性多糖中甘露糖和葡萄糖摩尔比为（3.86~6.99）:1.00（表 2），葡萄糖比例明显低于之前报道[6]，可能与本研究除去淀粉有关。
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表 2 铁皮石斛功能性多糖的单糖组成和糖苷键连接类型及摩尔比 Table 2 The compositional monosaccharides and their molar ratio glycosidic linkages specific polysaccharides in D. officinale |
甲基化分析是研究糖类结构的重要方法，它广泛用于寡糖和多糖糖苷键连接位置分析[14]。除DF13铁皮石斛枫斗样品外，不同铁皮石斛功能性多糖甲基化分析结果均显示：其主要糖苷键连接类型为1，4-Manp和1，4-Glcp，摩尔比为（4.51~7.89）: 1.00，同时还含有少量t-Manp和t-Glcp（表 2），提示：铁皮石斛功能性多糖是以1，4-Manp和1，4-Glcp为主链，与先前报道[13]一致。样品DF13多糖的单糖组成和糖苷键摩尔比与其他样品差异较大，是否由于加工过程所致有待进一步研究。
2.4 铁皮石斛功能性多糖特征性糖谱分析 2.4.1 部分酸水解参照先前报道进行部分酸水解[15]，即功能性多糖样品（5.0 mg）溶解于2.0 mL去离子水中，并加入三氟乙酸使最终浓度为1.0 mol·L-1，于80 ℃加热5 h；水解结束后，采用氮吹干燥，即得部分酸水解产物。
2.4.2 糖苷酶水解取功能性多糖溶液（5.0 mg功能性多糖样溶于2 mL去离子水）0.3 mL若干份，分别加入β-甘露聚糖酶（2.0 U·mL-1）和纤维素酶（20.0 U·mL-1），随后将混合液置于40 ℃保温16 h；反应结束后，将混合液置于80 ℃加热20 min，终止酶解；离心（4 000 g，15 min）除去变性酶，上清液经冷冻干燥（24 h）后即得酶水解产物，即得供试品溶液。用于样品浓缩和分离的浓缩胶和分离胶分别为0.1 mol·L-1 Tris-boric（pH 8.2）配制的8%（m/v）和20%（m/v）聚丙烯酰胺凝胶。电泳缓冲液为0.1 mol·L-1 Tris-硼酸（pH 8.2）。上样量为1~3 μL，先采用200 V分离10 min，再调整电压至700 V分离40 min，凝胶在UV 365 nm下成像。采用Quantity-One软件（版本4.6.2，美国伯乐公司）扫描PACE凝胶图上各条带光密度值，生成电子扫描特征图谱，随后采用计算机辅助相似性评价系统（版本1.290，由中南大学中药现代化研究中心及香港理工大学开发）创建各电子扫描特征图谱共有模式图谱并计算各特征图谱与共有模式图谱之间的相关系数。
TLC分析参照文献方法进行[15]，取“2.4.1”项下或“2.4.2”项下多糖部分酸水解产物或酶水解产物，用60%乙醇（0.1 mL）溶解制得供试品溶液后，作TLC分析。采用硅胶板（默克公司），展开剂为正丁醇-异丙醇-水-醋酸（7:5:2:1），展开至95 mm，取出吹干，用苯胺-二苯胺显色剂进行显色，显色后放置于加热板上105 ℃加热10 min，在日光灯下观察。
基于TLC和PACE糖谱法是针对多糖结构特征建立的一种功能性强、选择性高的表征多糖化学特征新方法[16-18]。PACE对寡糖片段分离能力要优于TLC，但需ANTS衍生试剂辅助且对单糖无分离作用；TLC对单糖分离效果要胜于PACE，两者组合使用，能够较全面地分析多糖水解产物特征[15]。图 3-A和图 3-B表明不同产地铁皮石斛功能性多糖样品在水解前不含小分子糖类化合物。铁皮石斛功能性多糖部分酸水解产物的TLC和PACE特征图谱见图 3-C和图 3-D，由图可见，除DF13铁皮石斛枫斗样品外，其余铁皮石斛功能性多糖条带均一致。采用Quantity-One软件采集PACE特征图谱中各条带光密度值，构建部分酸水解产物扫描图，并用计算机辅助相似性评价系统计算部分酸水解产物扫描图共有模式图谱，同时计算各样品与共有模式之间相似度，结果见表 3。除样品DF13相关系数为0.903 5外，其余样品相关系数均大于0.943 8，表明不同产地铁皮石斛功能性多糖部分酸水解产物具有相似特征。
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S1.由上至下：鼠李糖，木糖，甘露糖和阿拉伯糖（from up to down：Rha，Xyl，Man and Ara）S2.由上至下：岩藻糖，葡萄糖，半乳糖，昆布二糖，昆布四糖和半乳糖醛酸（from up to down：Fuc，Glc，Gal，laminaribiose，laminaritetraose，and GalA）S3.由上至下：昆布六糖至二糖，葡萄糖（from up to down：laminarihexaose，laminaripentaose，laminaritetraose，laminaritriose，laminaribiose，and Glc）KG.魔芋葡甘露聚糖（konjiac glucomannan） CMC.羧甲基纤维素（CM-cellulose）DF01-DF18.不同产地铁皮石斛（D. officinale from different locations） 图 3 铁皮石斛功能性多糖水解前（空白对照，A和B），部分酸水解（C和D）、β-甘露糖苷酶水解（E和F）和纤维素酶水解（G和H）后TLC和PACE特征图谱 Figure 3 TLC and PACE profiles of specific polysaccharide from D. officinale(A and B), and their partial acid(C and D), β-mannanase(E and F) and cellulase(G and H) hydrolysates |
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表 3 铁皮石斛多糖水解产物特征与其共有模式相关系数 Table 3 The correlation coefficient of individual hydrolysates of polysaccharides from D. officinale to their simulative mean chromatogram |
酶解具有高度结构特异性，因此比较不同来源铁皮石斛功能性多糖特定酶定向切割产物特征图谱，有利于了解不同铁皮石斛多糖化学结构特征。由单糖组成和甲基化分析结果并结合文献报道[3, 13]可知，铁皮石斛功能性多糖主要含有β-1，4-Manp和β-1，4-Glcp。因此，选用β-甘露糖苷酶和纤维素酶对样品进行酶解处理。TLC和PACE对酶解后样品的分析结果表明（图 3-E~H），各铁皮石斛样品的条带基本一致。各样品与共有模式之间相似度数据见表 3，除样品DF13差距较大外，其余样品β-甘露糖苷酶和纤维素酶水解产物图谱相关系数均分别大于0.925 4和0.912 0。该结果进一步说明：不同产地铁皮石斛功能性多糖在结构上具有较高的一致性。
3 结论不同产地铁皮石斛功能性多糖结构具有较高的一致性，功能性多糖是铁皮石斛较好的质量控制指标。
| [1] |
颜美秋, 陈素红, 周桂芬, 等. 不同种植年限铁皮石斛多糖、甘露糖含量的测定及其它化学成分比较研究[J]. 中华中医药学刊, 2015(4): 878. YAN MQ, CHEN SH, ZHOU GF, et al. Variation characteristics of polysaccharides and mannose content and chemical composition of n-butanol and ether portion for different cultivating years of D.officinale Kimura et Migo[J]. Chin Arch Tradit Chin Med, 2015(4): 878. |
| [2] |
诸燕, 斯金平, 郭宝林, 等. 人工栽培铁皮石斛多糖含量变异规律[J]. 中国中药杂志, 2010, 35(4): 427. ZHU Y, SI JP, GUO BL, et al. Quantitive variation of polysaccharides content in cultivated Dendrobium candidum[J]. China J Chin Mater Med, 2010, 35(4): 427. |
| [3] |
XING XH, CUI SW, NIE SP, et al. Study on Dendrobium officinale O-acetyl-glucomannan (Dendronan®):PartⅠ.Extraction, purification, and partial structural characterization[J]. Bioact Carbohydr Diet Fibre, 2014, 4(1): 74. DOI:10.1016/j.bcdf.2014.06.004 |
| [4] |
CAI HL, HUANG XJ, NIE SP, et al. Study on Dendrobium officinale O-acetyl-glucomannan (Dendronans®):Part Ⅲ-Immunomodulatory activity in vitro[J]. Bioact Carbohyd Diet Fibre, 2015, 5(2): 99. DOI:10.1016/j.bcdf.2014.12.002 |
| [5] |
刘亚娟, 王诗豪, 张铭, 等. 铁皮石斛多糖抗癌及免疫活性研究[J]. 广州化工, 2014, 42(10): 58. LIU YJ, WANG SH, ZHANG M, et al. Study on immune and antitumor activity of Dendrobium officinale polysaccharides[J]. Guangzhou Chem Ind, 2014, 42(10): 58. DOI:10.3969/j.issn.1001-9677.2014.10.021 |
| [6] |
MENG LZ, LÜ GP, HU DJ, et al. Effects of polysaccharides from different species of Dendrobium (Shihu) on macrophage function[J]. Molecules, 2013, 18(5): 5779. |
| [7] |
鲍素华, 查学强, 郝杰, 等. 不同分子量铁皮石斛多糖体外抗氧化活性研究[J]. 食品科学, 2009, 30(21): 123. BAO SH, ZHA XQ, HAO J, et al. In vitro antioxidant activity of polysaccharides with different molecular weights from Dendrobium candidum[J]. Food Sci, 2009, 30(21): 123. DOI:10.3321/j.issn:1002-6630.2009.21.029 |
| [8] |
FERREIRA SS, PASSOS CP, MADUREIRA P, et al. Structure-function relationships of immunostimulatory polysaccharides:a review[J]. Carbohydr Polym, 2015, 132: 378. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.05.079 |
| [9] |
HU DJ, CHEONG KL, ZHAO J, et al. Chromatography in characterization of polysaccharides from medicinal plants and fungi[J]. J Sep Sci, 2013, 36(1): 1. DOI:10.1002/jssc.v36.1 |
| [10] |
WU DT, XIE J, HU DJ, et al. Characterization of polysaccharides from Ganoderma spp.using saccharide mapping[J]. Carbohydr Polym, 2013, 97(2): 398. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.04.101 |
| [11] |
CHEONG KL, WU DT, ZHAO J, et al. A rapid and accurate method for the quantitative estimation of natural polysaccharides and their fractions using high performance size exclusion chromatography coupled with multi-angle laser light scattering and refractive index detector[J]. J Chromatogr A, 2015, 1400: 98. DOI:10.1016/j.chroma.2015.04.054 |
| [12] |
WU DT, MENG LZ, WANG LY, et al. Chain conformation and immunomodulatory activity of a hyperbranched polysaccharide from Cordyceps sinensis[J]. Carbohydr Polym, 2014, 110: 405. DOI:10.1016/j.carbpol.2014.04.044 |
| [13] |
HUA YF, ZHANG M, FU CX, et al. Structural characterization of a 2-O-acetylglucomannan from Dendrobium officinale stem[J]. Carbohydr Res, 2004, 339(13): 2219. DOI:10.1016/j.carres.2004.05.034 |
| [14] |
REES DA, WIGHT NJ. Molecular cohesion in plant cell walls.Methylation analysis of pectic polysaccharides from the cotyledons of white mustard[J]. .Biochem J, 1969, 115(3): 431. DOI:10.1042/bj1150431 |
| [15] |
WU DT, CHEONG KL, DENG Y, et al. Characterization and comparison of polysaccharides from Lycium barbarum in China using saccharide mapping based on PACE and HPTLC[J]. Carbohydr Polym, 2015, 134: 12. DOI:10.1016/j.carbpol.2015.07.052 |
| [16] |
李绍平, 吴定涛, 赵静. 糖谱及其在中药多糖质量控制中的应用[J]. 中国中药杂志, 2015, 40(17): 3505. LI SP, WU DT, ZHAO J. Saccharide mapping and its application in quality control of polysaccharides from Chinese medicines[J]. China J Chin Mater Med, 2015, 40(17): 3505. |
| [17] |
吴定涛, 巨瑶君, 陆静峰, 等. 糖谱法比较不同产地竹荪多糖结构特征[J]. 食品科学, 2014, 35(13): 98. WU DT, JU YJ, LU JF, et al. Characterization and comparison of polysaccharides from Dictyophora indusiata using saccharide mapping[J]. Food Sci, 2014, 35(13): 98. DOI:10.7506/spkx1002-6630-201413018 |
| [18] |
WU DT, CHEONG KL, WANG LY, et al. Characterization and discrimination of polysaccharides from different species of Cordyceps using saccharide mapping based on PACE and HPTLC[J]. Carbohydr Polym, 2014, 103: 100. DOI:10.1016/j.carbpol.2013.12.034 |