棉子糖系列寡糖（RFOs）作为一种天然食品添加剂和益菌因子，已被广泛应用于食品及功能性保健食品领域^[1]。RFOs是由数个半乳糖以α-（1，6）糖苷键连接在蔗糖上，所构成的一系列水溶性非还原糖。RFOs主要包括棉子糖（三糖）、水苏糖（四糖）和毛蕊花糖（五糖）等，具有改善葡萄糖耐受^[2]，抑制肝胆固醇^[3]，增强免疫^[4]和改善肠道菌群^[5]等多种生物活性。

RFOs广泛存在于植物界，是含量仅次于蔗糖的一类可溶性糖类成分^[6]。葫芦科、豆科、唇形科、木犀科、玄参科等多种植物均利用RFOs来转运和储存能量^[7]。在不同科属植物中，豆科植物种子如大豆^[8]、绿豆^[9]、三角豆^[10]、芸豆^[11]、豌豆^[12]、红豆^[13]等含有丰富RFOs。此外，RFOs也存在于一些药食两用植物如地黄、水苏等^[14]。为了开发富含RFOs新资源，建立定性、定量分析RFOs方法，明确其在不同科属植物中的分布具有重要意义。

目前，RFOs常用分析方法包括比色法^[15]、高效阴离子色谱联用脉冲安培检测器法（HPAEC-PAD）^[8]、亲水相互作用色谱联用蒸发光散射检测器法（HILIC-ELSD）^[16]，以及亲水相互作用色谱联用示差折光检测器法（HILIC-RID）^[17]等。其中，比色法简单、方便，但只能测定总糖含量，并且测定结果易受单糖类型影响。虽然HPAEC-PAD法分离度好，但糖类物质在碱性条件下易异构化和降解^[18]。HILIC虽有较好的分辨率，但RID和ELSD灵敏度均较低^{[16, 19]}，并且RID不适宜梯度洗脱，影响分离能力^[17]。近年来，电喷雾式检测器（CAD）作为一种新型通用检测器，已被成功应用于寡糖类化合物的分析检测^[20-21]。与ELSD检测器相似，CAD响应值不依赖于分析物的结构^[22]，并且CAD检测器灵敏度远高于ELSD和RID检测器^[23]。在前期工作中，本课题组成功应用HPLC-CAD法对菊型果寡糖^[20]、木寡糖^[24]等进行过分析，并研究了菊型果寡糖在不同植物中的含量。本研究应用HPLC-CAD结合高通量微波辅助提取技术，实现对不同生物来源样品中RFOs定性、定量分析。

1 仪器与试药

Multiwave 3000微波消解仪（Anton Paar GmbH公司），Ultimate 3000超高效液相系统，Chromeleon 6.8色谱工作站（Dionex公司），Waters Amide色谱柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm；填料：亚乙基桥杂化颗粒三键键合酰胺基；Waters公司）AG135与ARB120电子分析天平（Mettler Toledo公司），Millipore Milli-Q超纯水制备系统（Millipore公司）。

样品共16批，详细信息见表 1。豆科植物种子收集自澳门与珠海当地市场，生地黄、车前草和水苏主要购买于珠海当地药店。各批药材由澳门大学乔春峰博士鉴定确认。

棉子糖系列寡糖，主要包括棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖对照品由本实验室纯化制备^[25]，其纯度大于97%（w/w，HPLC-DAD-CAD法测定），结构信息见图 1。色谱级乙腈购于RCI Labscan公司，超纯水由Milli-Q超纯水制备系统制备，分析级乙醇购于天津市富宇精细化工有限公司。

2 方法与结果 2.1 对照品溶液制备

精密称取对照品（蔗糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖）适量，置5 mL量瓶中。加60%乙醇溶解并定容至刻度，摇匀，配制成质量浓度为2.0 mg·mL^-1混合对照品溶液，4 ℃储存备用。

2.2 供试品溶液制备

所有样品研磨成均匀细粉，过40目筛。参照本课题组已建立的方法^[20]，应用Multiwave 3000微波消解仪提取寡糖。精密称取待测样品干燥细粉0.1 g，置于5 mL提取瓶中，加入60%乙醇溶液2.0 mL。微波辅助提取，功率400 W，时间4 min，温度80 ℃。提取结束后，提取液离心（5 000×g，5 min）取上清液1 mL，置于10 mL量瓶中，用60%乙醇定容至刻度，溶液过0.45 μm微孔滤膜后作HPLC-CAD分析。

2.3 HPLC-CAD分析

采用Waters Amide色谱柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm），流动相为水（A）-乙腈（B），梯度洗脱（0~20 min，75%B→45%B，20~22 min，45%B→75%B，流速为1.0 mL·min^-1，柱温30 ℃，进样量10 μL，CAD氮气压力为0.24 MPa。

2.4 重复性及稳定性试验

精密称定豌豆样品粉末0.08、0.10、0.12 g各3份，按供试品溶液制备方法制备低、中、高浓度的供试品溶液，并测定含量，验证方法重复性。取中间浓度供试品溶液，在上述色谱条件下，分别于0、2、4、6、8、12、24、48 h进样分析，验证方法稳定性。

低、中、高浓度供试品溶液重复性RSD分别小于3.6%、3.8%和3.1%；稳定性试验结果（表 2）表明，供试品溶液在48 h内稳定性较好，RSD小于2.8%。说明该方法具有良好的重复性和稳定性。

2.5 样品分析

RFOs是一类可溶性非还原糖，采用HPLC-CAD方法测定不同来源（豆科、玄参科、唇形科和车前草科）样品中RFOs和蔗糖含量（图 2、表 3）。结果表明：豆科植物样品几乎都含有蔗糖和RFOs，但各种寡糖在不同来源豆科植物种子中含量差异较大，如眉豆与大豆中水苏糖和蔗糖含量最高。但在绿豆中毛蕊花糖含量最高，达总糖的45.3%。特别是RFOs在水苏和生地黄中含量非常高，总量分别达到426.19 mg·g^-1和373.40 mg·g^-1，但车前草中几乎检测不到。实际上，RFOs作为植物能量成分，主要储存在植物块茎（如生地黄）中，植物叶子（如车前草）中含量较少^[26]。

3 讨论

HILIC法是糖类化合物常用分析技术之一。通过比较不同HILIC色谱柱，本文选择Waters氨基柱（4.6 mm×250 mm，3.5 μm）用于RFOs和蔗糖分离，该色谱柱具有良好的分辨率和信噪比。另外，考察了不同梯度洗脱条件，最终建立的HILIC-CAD方法能在20 min内对待测成分实现良好分离和分析，蔗糖、棉子糖、水苏糖、毛蕊花糖均达到基线分离。

尽管已有大量研究证实RFOs存在于豆科、玄参科、唇形科和车前科植物中，但是少有研究系统比较这些科属代表植物中RFOs含量。当前市场上（特别是日本）RFOs主要来自大豆，但大豆中RFOs含量相对较低，进而限制了RFOs在健康产品中的应用^[27]。本研究结果表明：水苏和地黄富含大量RFOs，有望作为开发富含RFOs的新资源，本研究建立的HPLC-CAD方法也有利于对RFOs及其产品进行质量控制。