2017, Vol. 37 
大蜜丸是一种传统的中药剂型，属滋补药剂，适用于慢性疾病或调理气血[1-2]。安胎丸(大蜜丸)由当归、黄芩、白芍(炒)、川芎(制)、白术5味药材经粉碎后，以炼蜜为辅料制成，有养血安胎之功效[3]。炼蜜是大蜜丸的重要辅料[4-8]，是蜂蜜经高温炼制而成，安胎丸中炼蜜与药粉的比例为1: 1，炼蜜质量的优劣直接影响中成药的质量及服用安全性。
蜂蜜主要是以葡萄糖和果糖为主的各种糖类组成，以及有机酸、酶类等[9-11]，质量标准收载于中国药典2015年版一部[12]。一方面，目前市售蜂蜜产品的质量较混乱，存在掺伪现象，或使用转化糖浆(蔗糖经水解后得到等分子的葡萄糖和果糖)、麦芽糖浆(饴糖)、果葡糖浆等代替蜂蜜的情况[13-14]；另一方面，由蜂蜜制成的炼蜜在工艺上不统一、不规范，导致炼蜜中有害成分增加，葡萄糖、果糖等营养成分遭到破坏，从而间接影响中药的质量，特别是蜂蜜在炼制的过程中，果糖等单糖在高温下会产生5-羟甲基糠醛(5-HMF)，5-羟甲基糠醛对人体横纹肌及内脏有损害，具有神经毒性等危害[15-17]。为客观评价大蜜丸中辅料炼蜜的质量，本研究在国家药品评价性抽验工作[18]指导下，分别建立了安胎丸(大蜜丸)及其辅料炼蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和糖代谢产物5-羟甲基糠醛的测定方法，初步拟定了炼蜜以及安胎丸(大蜜丸)中糖类成分和5-羟甲基糠醛的限度，为炼蜜和大蜜丸的质量控制提供参考。
1 仪器与试药安捷伦公司Aglient 1200液相色谱仪(包括四元泵、UV检测器、柱温箱、自动进样器、工作站)；岛津公司LC-20AT液相色谱仪(包括四元泵、岛津RID-10A示差检测器、柱温箱、自动进样器、工作站)；Shodex公司Asahipak NH2P-50 4E(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：聚合物)色谱柱；Phenomenex公司Gemini C18110A(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)色谱柱；Sartorius CP224S(d=0.1mg)、CP225D(d=0.01mg)电子天平；Millipore纯水仪。乙腈为色谱纯，水为纯净水，其他试剂均为分析纯。
果糖(批号100231-201305，纯度99.4%)、D-无水葡萄糖(批号110833-201205，纯度99.5%)、蔗糖(批号111507-201303，纯度99.8%)、麦芽糖(批号100287-201303，纯度94.3%)均购自中国食品药品检定研究院。5-羟甲基糠醛(批号40716，纯度98.0%)购自Dr. Ehrenstorfer。安胎丸(大蜜丸)共46批(批号150501、150502、150306、150211、150307等)，来源于泉州中侨(集团)药业股份有限公司、广西梧州制药(集团)股份有限公司、江西芙蓉堂药业有限公司、江西保利制药有限公司、广西梧州三鹤药业有限公司、广东逢春制药有限公司、广东三蓝药业股份有限公司。蜂蜜及对应的炼蜜10批(批号1503030、1503031、1503032等)由广东逢春制药有限公司提供。
2 方法与结果 2.1 色谱条件 2.1.1 糖类成分测定采用岛津公司LC-20AT液相色谱仪，ShodexAsahipak NH2P-50 4E(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-水溶液(75: 25)为流动相，流速为1 mL·min-1，以示差检测器检测，柱温40℃，进样量20 μL。
2.1.2 5-羟甲基糠醛测定采用安捷伦公司Aglient 1200液相色谱仪，Phenomenex Gemini C18110A(250 mm×4.6 mm，5 μm)色谱柱，以乙腈-0.5%醋酸溶液为流动相(3: 97)，流速1 mL·min-1，检测波长284 nm，柱温30 ℃，进样量10 μL。
2.2 溶液的配制 2.2.1 糖类成分混合对照品溶液分别取果糖、D-无水葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含果糖4 mg，D-无水葡萄糖4 mg，蔗糖1.5 mg，麦芽糖0.8 mg的混合溶液，即得。
2.2.2 5-羟甲基糠醛对照品溶液取5-羟甲基糠醛对照品适量，精密称定，加水制成每1 mL含5-羟甲基糠醛15 μg的溶液，即得。
2.2.3 供试品溶液取炼蜜或蜂蜜约1 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水约90 mL，超声(功率350 W，频率37 kHz)处理15 min，放冷，用水定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得炼蜜或蜂蜜供试品溶液。取安胎丸(大蜜丸)样品，剪碎，取约1 g，精密称定，置50 mL量瓶中，加水约40 mL，超声(功率350 W，频率37 kHz)处理15 min，放冷，用水定容至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，即得安胎丸(大蜜丸)供试品溶液。
2.2.4 阴性对照溶液按处方比例称取当归、川芎、黄芩、白芍、白术药材适量，按安胎丸(大蜜丸)供试品溶液的制备方法操作，同法制备炼蜜的阴性对照溶液。
2.3 线性关系考察取果糖约40 mg，D-葡萄糖约40 mg，蔗糖约15 mg，麦芽糖约8 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加水溶解并定容至刻度，即得糖类成分混合对照品溶液(含果糖4.03 mg·mL-1，D-葡萄糖4.05 mg·mL-1，蔗糖1.54 mg·mL-1，麦芽糖0.82 mg·mL-1)，取糖类成分混合对照品溶液分别进样25、22、20、10、5、3、1 μL，记录对照品峰面积。取5-羟甲基糠醛约15 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，摇匀，即得对照品储备液(0.15 mg·mL-1)，将对照品储备液逐级稀释为含5-羟甲基糠醛质量浓度分别为15.5、1.55 μg·mL-1的工作对照溶液。取5-羟甲基糠醛工作对照溶液分别进样20、10、5、3、1 μL，记录对照品峰面积。以对照品峰面积为纵坐标，进样量为横坐标，分别绘制果糖、D-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和5-羟甲基糠醛的标准曲线，回归方程见表 1，各成分线性关系良好。
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表 1 糖类成分和5-羟甲基糠醛的线性曲线、检测限和定量限 Table 1 Linear regression curves, LODs and LOQs of carbohydrate components and 5-HMF |
用糖类成分混合对照品溶液和5-羟甲基糠醛工作对照溶液(1.55 μg·mL-1)进行逐级稀释测定检测限与定量限，信噪比为3: 1时测得检测限，信噪比为10: 1测得定量限，糖类成分和5-羟甲基糠醛的检测限与定量限见表 1。
2.5 精密度试验取果糖、D-葡萄糖、蔗糖、麦芽糖的混合对照品溶液和5-羟甲基糠醛工作对照溶液(15.5 μg·mL-1)，按“2.1”项下色谱条件，连续进样6次，计算各成分峰面积的RSD。结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和5-羟甲基糠醛峰面积的RSD(n=6)分别为0.2%、0.4%、1.1%、1.3%和0.4%，表明仪器精密度良好。
2.6 重复性试验取同一批号的炼蜜(广东逢春制药有限公司，批号1503030)和同一批号安胎丸样品(广东逢春制药有限公司，批号141201)，分别按“2.2.3”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.1”项下色谱条件进样测定。结果(见表 2)表明本法重复性良好。
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表 2 重复性考察结果(%，n=6) Table 2 Results of reproducibility test |
取同一批供试品溶液(广东逢春制药有限公司，样品批号140901)，分别于0、2、4、18、24 h依次进样，测定峰面积。结果果糖、葡萄糖、蔗糖和5-羟甲基糠醛峰面积的RSD分别为0.1%、0.3%、1.6%和1.7%，表明供试品溶液在室温下24 h内稳定。
2.8 回收率试验取已知含量的同一批安胎丸样品(广东逢春制药有限公司，批号141201，果糖、葡萄糖、蔗糖和5-羟甲基糠醛的含量分别为18.8%、15.6%、4.6%和0.064%)，糖类成分的回收率试验取样0.25 g，5-羟甲基糠醛的回收率试验取样0.5 g，按照对照品加入量与所取供试品中各成分含有量1.5: 1、1: 1、0.5: 1的比例加入对照品，分别按“2.2.3”项下方法制备高、中、低3个不同浓度的供试溶液各3份，进行HPLC测定，计算加样回收率。结果见表 3，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和5-羟甲基糠醛的平均回收率为100.7%、97.1%、100.0%、101.4%和97.61%，RSD分别为0.9%、2.0%、3.3%、2.4%和2.8%，表明方法准确度符合要求。
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表 3 回收率试验结果 Table 3 Results of recovery test |
分别取糖类成分混合对照品溶液、5-羟甲基糠醛对照品溶液、供试品溶液(广东逢春制药有限公司，样品批号141201)和炼蜜的阴性对照溶液，按“2.1”项下色谱条件进行HPLC分析，果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖和5-羟甲基糠醛色谱峰分离度良好。由于药材里含有糖类成分，该产品为粉末投料，故阴性对照样品有少量糖类成分检出，果糖和葡萄糖约占安胎丸含量的3.1%~4.8%，对测定结果无影响。蔗糖含量约占安胎丸含量的8.3%~12.9%，对样品中蔗糖的测定结果有一定影响，进一步对处方中5味药材进行了测定，结果表明每味药材都有蔗糖成分检出，考虑药材不同产地不同采收季节的影响，故安胎丸中蔗糖的限度待积累数据后再考察(见图 1)。
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1.5-羟甲基糠醛(5-HMF) 2.果糖(fructose) 3.葡萄糖(glucose) 4.蔗糖(sucrose) 5.麦芽糖(maltose) A.5-羟甲基糠醛对照品(5-hydroxymethylfurfural reference substance) B.用于5-羟甲基糠醛测定的安胎丸供试品(批号141201)(Antai pill sample for 5-hydroxymethylfurfural determinant) C.用于5-羟甲基糠醛测定的炼蜜阴性对照(negative sample without refined honey for 5-hydroxymethylfurfural determinant) D.糖类成分混合对照品溶液(carbohydrate components mixed reference substance) E.用于糖类成分测定的安胎丸供试品(批号141201)(Antai pill sample for carbohydrate components determinant) F.用于糖类成分测定的炼蜜阴性对照(negative sample without refined honey for carbohydrate components determinant) 图 1 安胎丸高效液相色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of Antai pills |
按拟定的含量测定方法，对7个生产企业的共46批安胎丸(大蜜丸)样品、生产企业提供的11批炼蜜和7批蜂蜜进行了测定，通过线性回归方程计算含量，结果见表 4。
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表 4 样品测定结果 Table 4 Content determination of 5-HMF and carbohydrate components in samples |
中国药典2015年版一部“蜂蜜”项下规定，果糖和葡萄糖的总量不得少于60.0%，果糖与葡萄糖含量比值不得小于1.0，蔗糖和麦芽糖含量均不得过5.0%，含5-羟甲基糠醛不得过0.004%[12]。测定结果(表 4)显示，蜂蜜经高温炼制后，5-羟甲基糠醛的含量增加10~50倍[2, 9, 15]，按100倍折算，拟定炼蜜中5-羟甲基糠醛的含量不得过0.40%，其余项目与“蜂蜜”项下规定相同，为炼蜜的质量控制提供参考，规范炼蜜的过程，尤其是对温度的控制，提高大蜜丸的质量。
3.2 安胎丸限度的制订安胎丸“制法”项规定，每100 g粉末加炼蜜120~130 g，根据本研究拟定的炼蜜标准，安胎丸中果糖和葡萄糖的总量不得少于30%，5-羟甲基糠醛的含量不得过0.20%，麦芽糖含量不得过3.0%。由于安胎丸阴性对照样品在蔗糖峰保留时间处有干扰，我们对处方中5味药材进行了果糖、葡萄糖、蔗糖和麦芽糖的测定，结果表明每味药材都有蔗糖成分检出，考虑药材不同产地不同采收季节的影响，故蔗糖的含量限度待积累数据后再考察。
3.3 样品提取方法、色谱条件的选择样品提取过程中，比较了超声和加热回流等方式，结果经加热回流提取，样品中5-羟甲基糠醛含量明显增加，故采用超声提取。同时比较了水、15%、50%、75%、100%甲醇的提取溶液，25、50、100 mL等不同的提取体积，10、15、20、30、40 min等不同的提取时间，结果用水提取时，炼蜜溶解更快。考察了甲醇-0.5%醋酸溶液、乙腈-0.1%醋酸溶液、乙腈-0.5%醋酸溶液、甲醇-水等不同的流动相和Ecosil C18-Extend(150 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)、SHISEIDO MGⅡC18(150 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)、PhenomenexKinetex C18(250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)等不同品牌色谱柱，结果果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及5-羟甲基糠醛分离度均良好。
3.4 小结本研究建立了安胎丸(大蜜丸)及辅料炼蜜中果糖、葡萄糖、蔗糖、麦芽糖及糖代谢产物5-羟甲基糠醛的含量测定方法，操作简便快速，结果准确可靠，为大蜜丸及辅料炼蜜的质量控制和评价提供了参考和思路。
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