2017, Vol. 37 
2. 山东大学, 济南 250100;
3. 中国食品药品检定研究院, 北京 100050
2. Shandong University, Jinan 250100, China;
3. National Institutes for Food and Drug Control, Beijing 100050, China
阿胶由驴皮熬制而成[1]，具有补血滋阴、润燥、止血的功效[2-4]。随着阿胶药材需求不断上升，以及生产原料驴皮供应量的限制，阿胶价格昂贵，阿胶药材的掺伪造假问题日趋严重，存在使用其他劣质皮类替代驴皮熬制阿胶的违法问题。马皮、牛皮、猪皮、羊皮供应量大，价格便宜，是阿胶掺伪中用到的可能性较大的皮源[5-6]。
阿胶的主要成分是驴皮胶原蛋白高温不完全水解后的肽段[7]。不同物种的蛋白序列存在差异，胰蛋白酶可识别多肽链中的赖氨酸和精氨酸切割多肽链，如果赖氨酸和精氨酸的后一个氨基酸是脯氨酸，胰蛋白酶不切割此位点[8]。不同物种的蛋白序列经胰蛋白酶酶切后可能形成物种特异性的多肽，蛋白酶酶切技术和质谱多肽识别技术已经被广泛应用于动物胶原蛋白的鉴别[9-12]。利用质谱和主成分分析的方法发现了牛皮胶原蛋白特征肽，建立了胶类药材中牛皮源成分的专属性检测方法[13-16]，有效地打击了阿胶中掺入牛皮源成分的违法行为；还发现了相对于牛皮胶、猪皮胶、龟甲胶、鹿角胶具有特异性的驴皮源成分特征肽[17-19]，建立了阿胶、龟甲胶、鹿角胶中驴皮源成分的检测方法，广泛地应用于胶类药材的检测。本研究针对利用马皮、猪皮、牛皮、羊皮冒充驴皮熬制阿胶的造假行为，通过比对驴、马、猪、牛、羊胶原蛋白的序列，模拟胰蛋白酶酶切的结果，获得了一条理论的相对于马、猪、牛、羊具有特异性的驴胶原蛋白特征性多肽，通过合成驴皮特征肽，在纳升液相色谱-高分辨质谱上得到了进一步确证，并进一步采用超高效液相色谱-三重四极杆质谱联用仪建立了阿胶中驴皮源成分的专属性鉴别方法，并进行了方法学验证。
1 仪器与材料 1.1 仪器EASY-nLC 1000纳升液相色谱仪(美国热电科技公司)，Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪(美国热电科技公司)；自制纳升液相色谱富集色谱柱(0.2 mm×3.5 cm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，孔球形硅胶粒径5 μm，德国迈克公司)，自制纳升液相色谱分析色谱柱(75 μm×25 cm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，孔球形硅胶粒径3 μm，德国迈克公司)。Waters Acquity超高效液相色谱仪、Waters Quattro Premier XE三重四极杆质谱仪(沃特世科技公司)；Waters ACQUITY UPLC BEH C18色谱柱(2.1 mm×150 mm，1.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶，桥式亚乙基杂化颗粒(沃特世科技公司)。KQ200DB超声清洗仪(中国昆山超声仪器有限公司)。XSE205电子天平(赛多利斯科学仪器有限公司)。
1.2 试剂碳酸钠、碳酸氢铵为分析纯；甲酸、乙腈为色谱纯；水为Milli-Q纯水；胰蛋白酶购自Sigma公司，货号T1426-100 mg。驴皮特征肽GPTGEPGKPGDK由上海强耀生物科技有限公司合成，纯度为98%。
1.3 胶类样品阿胶对照药材购自中国食品药品检定研究院，编号为121274-201202；自制阿胶(6份)、自制猪皮胶(3份)、自制马皮胶(3份)、自制牛皮胶(3份)、自制羊皮胶(3份)由以下制备工艺获得：取鲜皮10 g，去毛，水浸泡4 d，每天换水2次，1%碳酸钠水溶液浸泡1 d，水洗净，加水90 mL，115 ℃熬制8 h获得胶液，胶液滤过，滤液浓缩成稠膏，100 ℃真空干燥箱干燥4 h获得胶。
阿胶样品由生产厂家提供，具体信息见表 1。
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表 1 阿胶样品信息 Table 1 Information of sample |
阿胶中的主要成分为驴皮胶原蛋白水解后的多肽。皮类胶原蛋白主要由Ⅰ型胶原蛋白组成，占80%~85%，Ⅰ型胶原蛋白又包括Ⅰ型α1、α2亚型。通过对驴与马、牛、猪、羊的Ⅰ型α1、α2胶原蛋白序列进行blast多序列比对，发现不同物种胶原蛋白COL Ⅰ α2之间存在差异(图 1)；通过模拟胰蛋白酶酶切驴胶原蛋白获得一条理论的驴相对于马、牛、猪、羊的胶原蛋白特征肽，序列为GPTGEPGKPGDK，对应驴皮胶原蛋白COL Ⅰ α2的第497-508个氨基酸。
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图 1 胶原蛋白COL Ⅰ α2序列比对 Figure 1 Sequence alignment of collagen Ⅰ α2 |
精密称定胶类药材0.10 g，置50 mL量瓶中，加1%碳酸氢铵溶液40 mL，超声(100 W，40 kHz)处理30 min，使样品完全溶解并加1%碳酸氢铵溶液定容至刻度，过0.22 μm的滤膜，取100 μL续滤液至200 μL微量进样瓶中，加2 μL胰蛋白酶溶液(取序列分析纯胰蛋白酶适量，加1%碳酸氢铵溶液溶解，制成每1 μL中含20 μg的溶液)，摇匀，37 ℃恒温酶解16 h，即得。
2.3 纳升液相色谱和Fusion-Orbitrap高分辨质谱条件采用EASY-nLC 1000纳升液相色谱系统分离。流动相A为2%乙腈的0.1%甲酸水溶液，流动相B为含98%乙腈的0.1%甲酸水溶液，洗脱梯度设置见表 2，进样量为1 μL。首先采用自制纳升液相色谱富集色谱柱进行富集，并串联自制纳升液相色谱分离色谱柱进行分析。
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表 2 纳升液相色谱梯度洗脱程序 Table 2 Gradient elution program of nano liquid chromatography |
采用Fusion-Orbitrap高分辨质谱仪，离子源为Nanospray Flex纳喷源。以正离子模式进行分析，喷雾电压为2.1 kV，离子传输毛细管温度为275 ℃，S-Lens传输效率设置为60%。一级质谱采用Orbitrap作为质量分析器，分辨率为60 000(m/z 400)，采集范围为350~1 650 Th；二级质谱采用离子阱作为质量分析器，采用Rapid Scan模式进行扫描，利用Top 20数据依赖模式进行母离子选择，采用CID模式进行碎裂，碎裂能量NCE设置为35%。
2.4 超高效液相色谱和三重四极杆质谱条件采用超高效液相系统，色谱柱为ACQUITY UPLC® BEH C18(2.1 mm×100 mm，1.7 μm)，流速0.3 mL·min-1，流动相A为0.1%甲酸溶液，B为0.1%甲酸乙腈，进行梯度洗脱，洗脱程序见表 3，进样量5 μL。
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表 3 超高效液相色谱梯度洗脱程序 Table 3 Gradient elution program of UPLC |
采用Waters Quattro Premier XE三重四极杆质谱系统，电喷雾离子化(ESI)，正离子模式下，进行多反应监测，选择m/z 380.71→374.82，493.56作为检测离子对。
2.5 驴皮特征肽的验证采用供试品溶液制备方法制备阿胶对照药材溶液，注入EASY-nLC 1000纳升液相色谱-Fusion-Orbitrap高分辨质谱联用仪进行分析，以全部驴胶原蛋白序列为数据库，将阿胶酶解后的多肽质谱信息用SEQUEST软件进行数据库搜索，特征肽的提取离子流色谱(EIC)、二级质谱如图 2-A、B所示，证实了驴皮特征肽GPTGEPGKPGDK的存在。为了进一步确证驴皮特征肽，委托上海强耀公司合成了特征肽，并对合成的多肽进行高分辨质谱检测，其选择离子色谱峰与样品中的待检色谱峰的保留时间一致(图 2-C、D)；二级质谱图也一致。驴皮特征肽二级质谱碎片信息归属与理论一致，见图 3，进一步验证的驴皮特征肽。
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A、B.阿胶对照药材中的驴皮特征肽(marker peptide in donkey hide gelatin reference drug) C、D.合成的驴皮特征肽(synthetic marker peptide) 图 2 驴皮特征肽提取离子流色谱和二级质谱图 Figure 2 The extracted ion chromatogram and MS/MS spectra of marker peptide |
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图 3 驴皮特征肽离子碎片信息归属 Figure 3 Identification of marker peptide fragment ion |
按供试品制备方法制得阿胶对照药材以及自制阿胶(6份)、猪皮胶(3份)、马皮胶(3份)、牛皮胶(3份)、羊皮胶(3份)的供试品溶液，注入超高效液相色谱和三重四极杆质谱仪进行平行测定，检测结果如图 4所示，阿胶中驴皮特征肽GPTGEPGKPGDK的特征峰m/z 380.71→374.82，493.56的保留时间在2.21 min，猪皮胶、马皮胶、牛皮胶、羊皮胶在2.21 min无驴皮特征肽的特征峰m/z 380.71→374.82，493.56，说明该方法的专属性强。
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1.阿胶对照药材(donkey hide gelatin reference drug) 2.马皮胶(horse hide gelatin) 3.牛皮胶(cattle hide gelatin) 4.猪皮胶(pig hide gelatin) 5.羊皮胶(sheep hide gelatin) A.m/z 380.71→374.82 B.m/z 380.71→493.56 图 4 驴皮特征肽的MRM色谱图 Figure 4 MRM chromatograms of marker peptide |
取阿胶对照药材溶液，以m/z 380.71→374.82，493.56作为驴皮特征肽的特征离子进行检测，分别于0、2、4、8、16、24 h测定，保留时间为2.21 min，RSD(n=6)为5.0%。结果表明阿胶对照药材溶液在24 h内基本稳定。
2.8 重复性试验取阿胶对照药材平行制备6份溶液，以m/z 380.71→374.82、493.56作为检测离子对进行测定，保留时间为2.21 min，RSD(n=6)为5.9%，结果表明6份样品的测定具有较好的重复性。
2.9 样品的测定以所建立的方法对10份阿胶样品进行了检测，结果如图 5所示，均检出了驴皮特征肽的特征峰。
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A.m/z 380.71→374.82 B.m/z 380.71→493.56 图 5 样品中驴皮特征肽的MRM色谱图 Figure 5 MRM chromatograms of marker peptide in sample |
取按照供试品溶液制备方法制备的阿胶对照药材溶液，选择母离子为两电荷的离子对m/z 570.31→698.37，416.24和母离子为三电荷的离子对m/z 380.71→374.82，493.56进行监测分析，结果见图 6，三电荷的驴皮特征肽离子的响应明显优于两电荷的驴皮特征肽离子，因此选择m/z 380.71→374.82，493.56作为驴皮特征肽的监测离子对。
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图 6 监测离子的选择对驴皮特征肽检测的影响 Figure 6 Effect of different precursor/product ion pair on detection of marker peptide |
参照阿胶中牛皮源质量补充检验方法中的色谱条件[20]，采用0.1%甲酸溶液(A)-乙腈(B)作为流动相，按该补充检验方法中的洗脱条件驴皮特征肽的保留时间约为1.5 min，保留时间短，进一步优化梯度洗脱条件，最终确认本实验所用的梯度洗脱条件，驴皮特征肽的保留时间为2.21 min，分离效果良好。
3.3 质谱条件以多反应检测(MRM)方式对质谱参数进行优化，最终确定，毛细管电压为3.5 kV，离子源温度为150 ℃，除溶剂温度为450 ℃，除溶剂气体为850 L·h-1。同时，对锥孔电压和碰撞能量等进行优化，最终确定锥孔电压为18 V，碰撞能量为15 V。
3.4 酶解条件的考察酶解方法的构建参照中国药典第四部[21]“肽图检查法—第一法胰蛋白酶裂解-反相高效液相色谱法”。为保证胶类药材中的驴皮胶原蛋白成分被完全酶解，驴皮特征肽被充分释放，取阿胶对照药材按供试品溶液制备方法操作，分别在37 ℃恒温酶解0、4、8、16、24 h后进样，以选择离子m/z 380.71→374.82的峰面积考察样品酶解的情况，结果如图 7，在16 h后选择离子m/z 380.71→374.82的峰面积基本无变化，说明样品在16 h内已经被充分酶解。
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图 7 酶解时间对特征肽检测的影响 Figure 7 Effect of enzymatic hydrolysis time on marker peptide detection |
阿胶是驴皮高温熬制的产物，驴皮中的主要蛋白是胶原蛋白，阿胶的主要成分是胶原蛋白不完全水解后的多肽。本文首先将驴、马、猪、牛、羊的胶原蛋白序列进行比对，通过模拟胰蛋白酶酶切获得驴相对于其他物种的理论特征肽序列，再通过液相色谱-高分辨质谱联用的蛋白质组技术确证特征肽，该研究思路有较强的针对性和理论依据，可用于发现其他食品药品物种源性鉴定用特征肽。本文利用发现的驴皮特征肽建立阿胶中驴皮源成分的检测方法，该方法的专属性强，驴皮特征肽在室温下24 h内稳定，可用于阿胶中驴皮源成分的鉴别。
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