牛黄镇惊丸由牛黄、全蝎、炒僵蚕、珍珠、人工麝香、朱砂、雄黄、天麻、钩藤、防风、琥珀、胆南星、制白附子、半夏(制)、天竺黄、冰片、薄荷、甘草共18味中药材粉碎、配研制成，具有镇惊安神、祛风豁痰的功效，用于小儿惊风、高热抽搐、牙关紧闭、烦躁不安等症^[1]，属于临床急重病症用药。牛黄镇惊丸自1963年版起，收载于历版中国药典，现执行2010年版第一增补本标准或2015年版标准。现行标准没有含量测定项目，对君药牛黄也缺少质量控制项目。目前文献中对其含量测定的研究报道亦较少^[2-4]。本文针对处方中君药牛黄及占比较大的药味防风、甘草，选择牛黄的活性成分胆酸，防风中具有解热、镇痛、抗炎等活性^[5-8]的升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷，以及甘草中具有护肝、抗抑郁、抗病毒、抗肿瘤等活性^[9-16]的甘草苷、甘草酸共5个成分为指标，建立HPLC-DAD-ELSD含量测定方法，以期为客观地评价牛黄镇惊丸的质量及进一步完善其质量标准提供科学依据。

1 仪器与试药

沃特世公司WATERS 2996高效液相色谱仪，菲罗门公司Phenomenex Luna 5 μ C₁₈(2)100 A色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)，梅特勒-托利多公司Mettler AE240、Mettler XS105DU电子天平，昆山市超声仪器有限公司KQ-300DA型医用数控超声波清洗器(功率300 W，频率40 kHz)。

对照品升麻素苷(批号111522-201511，含量以94.8%计)、5-O-甲基维斯阿米醇(批号111523-201509，含量以95.8%计)、甘草苷(批号111610-201607，含量以93.1%计)、甘草酸铵(批号110731-201619，含量以93.0%计)、胆酸(批号100078-201415，含量以100%计)均来自中国食品药品检定研究院。

牛黄镇惊丸共8批，来自2家生产企业，均为市售样品。

乙醇为分析纯，乙腈为色谱纯，，水为Milli-Q系统制备。

2 方法与结果 2.1 溶液制备 2.1.1 混合对照品溶液

精密称取对照品升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸铵、胆酸适量，加70%乙醇溶液制成每1 mL分别含0.6、0.7、0.8、0.6、1.0 mg的溶液，作为混合对照品储备溶液；分别精密移取上述混合对照品储备溶液1、1、3、10、2 mL于同一25 mL量瓶中，加70%乙醇溶液稀释至刻度，摇匀，即得。

2.1.2 供试品溶液

取本品10丸，剪碎，取约1.5 g，精密称定，加入等量硅藻土，置具塞锥形瓶中，精密加入70%乙醇溶液50 mL，密塞，称量，超声处理(功率350 W，频率40 kHz)30 min，放冷，再称量，用上述溶液补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液25 mL蒸干，加水10 mL，用正丁醇萃取3次，每次10 mL，合并正丁醇萃取液，蒸干，残渣加甲醇溶解，转移至5 mL量瓶中，用甲醇稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜滤过，取续滤液，即得。

2.1.3 阴性样品溶液

按处方分别制备缺防风、缺甘草和缺牛黄的阴性样品；分别按“2.1.2”项下方法操作，即得各阴性样品溶液。

2.2 色谱条件

色谱柱：Phenomenex Luna 5 μ C₁₈(2)100 A(4.6 mm×250 mm，5 μm)；流动相：以乙腈为流动相A，0.2%甲酸水溶液为流动相B，梯度洗脱(0~5 min，5%→15%A；5~20 min，15%→25%A；20~25 min，25%→35%A；25~40 min，35%→60%A；40~54 min，60%→95%A)；流速：1.0 mL·min^-1；升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷和甘草酸的检测波长为254 nm；胆酸检测使用ELSD检测器，漂移管温度110 ℃，氮气流速3.2 L·min^-1；进样量：10 μL。色谱图见图 1。

2.3 方法学考察 2.3.1 线性关系考察

取混合对照品溶液，分别进样1、2、5、10、15、20 µL，记录峰面积。以进样量X为横坐标，峰面积Y为纵坐标绘制升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸的标准曲线并进行线性回归，以进样量对数X为横坐标，峰面积对数Y为纵坐标绘制胆酸的标准曲线并进行线性回归，5个成分的线性范围、回归方程、相关系数见表 1。

2.3.2 检出下限和定量下限

将“2.1.1”项下的混合对照品溶液稀释至不同浓度，进样测定，以信噪比3: 1为检测限(LOD)、10: 1为定量限(LOQ)，测定结果见表 1。

2.3.3 专属性试验

分别精密吸取混合对照品溶液、供试品溶液及3种阴性样品溶液各10 μL，注入液相色谱仪中，记录色谱图。试验结果表明，在升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷、甘草酸保留时间处无其他成分干扰；由于处方中含胆南星等药味，在胆酸保留时间处有一较小的峰，但与样品色谱峰相比可忽略不计(见图 1)。

2.3.4 精密度试验

取“2.1.1”项下混合对照品溶液连续进样5次，升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、胆酸峰面积的RSD分别为1.1%、1.1%、1.1%、1.2%和1.9%，表明方法精密度良好。

2.3.5 重复性试验

分别精密称取牛黄镇惊丸样品(批号15013204)6份，按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，测得升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、胆酸的平均含量为0.09、0.76、0.10、1.35、0.53 mg·g^-1，RSD分别为2.7%、1.4%、1.6%、1.9%、1.6%，表明方法重复性良好。

2.3.6 稳定性试验

取“2.3.5”项下同一供试品溶液，分别于0、2、8、16、24 h测定峰面积，结果升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、胆酸峰面积的RSD分别为2.2%、2.1%、1.8%、1.6%、1.1%，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。

2.3.7 回收率试验

精密称取已测知5个成分含量的牛黄镇惊丸样品0.75 g共6份，分别精密加入升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、胆酸质量浓度分别为1.55、11.41、1.45、21.28、8.10 mg·mL^-1的混合对照品溶液50 mL，按“2.1.2”项下方法平行制得6份供试溶液，进样测定，结果升麻素苷、甘草苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草酸、胆酸的平均回收率分别为91.4%、101.0%、104.3%、96.4%、98.9%，RSD为4.6%、2.4%、3.6%、3.2%和3.1%，见表 2。

2.4 样品测定

取8批牛黄镇惊丸样品，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.2”项色谱条件下进样测定，以外标法计算含量，结果见表 3。

3 讨论 3.1 检测器的选择及条件优化

牛黄镇惊丸中升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷和甘草酸4个成分分子中均含有共轭结构，具有较好的紫外吸收，适用于紫外检测器；胆酸为具有甾体母核的胆烷酸类化合物，分子中无共轭结构，无紫外特征吸收，因此采用蒸发光散射检测器测定。参照2015年版中国药典防风、甘草含量测定项下测定波长，选择254 nm作为紫外检测波长。由于流动相梯度洗脱初始条件水相比例较大，因此漂移管温度设定为110 ℃；实验中对氮气流速(3.2、3.0 L·min^-1)进行优化，结果3.2 L·min^-1时基线较为平稳，利于测定。

3.2 测定结果分析

牛黄镇惊丸属于国家食品药品监督管理总局在“关于牛黄及其代用品使用问题的通知(国食药监注[2004]21号)”中列出的42种临床急重病症用药品种之一，处方中牛黄可用牛黄或体外培育牛黄投料。实验中收集到的8批样品共涉及2家生产企业。按照包装及说明书标识，A企业样品均为体外培育牛黄投料，B企业样品均为牛黄投料。样品胆酸测定值在0.475~1.922 mg·g^-1。中国药典2015年版规定天然牛黄“含胆酸不得少于4.0%”；体外培育牛黄“含胆酸不得少于6.0%”。按处方量折算得到牛黄、体外培育牛黄投料样品中胆酸含量的理论值分别为0.575 mg·g^-1和0.862 mg·g^-1。A企业1批样品胆酸含量低于理论值的55%，表明原料质量较差或存在投料不足的可能。B企业5批样品胆酸测定值均在理论值的85%以上，表明牛黄投料情况较好。

8批样品升麻素苷、5-O-甲基维斯阿米醇苷、甘草苷和甘草酸测定值分别在0.027~0.113、0.544~0.954、0.046~0.140和0.985~1.672 mg·g^-1。中国药典2015年版规定防风“含升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷的总量不得少于0.24%”；甘草“含甘草苷不得少于0.50%”，“含甘草酸不得少于2.0%”。按处方量折算得到升麻素苷和5-O-甲基维斯阿米醇苷总量理论值为0.086 mg·g^-1，甘草苷含量理论值为0.359 mg·g^-1，甘草酸含量理论值为1.437 mg·g^-1。大部分样品实际测定值在上述理论值的80%以上，仅1批样品甘草酸低于理论值的70%，表明防风、甘草的投料情况较好。

本实验采用HPLC-DAD-ELSD技术建立同时测定牛黄镇惊丸中5个成分含量的方法，快速、准确，可为客观评价牛黄镇惊丸质量提供科学依据。