2017, Vol. 37 
龙胆泻肝丸是由龙胆泻肝汤通过剂型改革制成的现代中成药制剂，收载于中国药典2015年版一部，具有清肝胆及利湿热的功效[1]，临床主要用于肝胆湿热、头晕目赤、耳鸣耳聋、耳肿疼痛、胁痛口苦、尿赤涩痛及湿热带下等症[2-5]。其处方由龙胆、栀子、黄芩、柴胡、泽泻、木通、盐车前子、酒当归、炙甘草和地黄共10味药材组成，其中，龙胆为君药，栀子、黄芩为臣药。研究表明，龙胆苦苷和獐牙菜苦苷为龙胆中的代表性环烯醚萜苷类成分，具有抗炎、镇痛、保肝等作用[6-8]；京尼平苷和京尼平龙胆双糖苷为栀子中的代表性环烯醚萜苷类成分，具有保肝、抗炎、抗氧化、抗血栓等作用[7-11]；黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素为黄芩中的代表性黄酮类成分，具有抗炎、抗肿瘤、抗血栓等作用[12-14]。中国药典2015年版仅以龙胆苦苷、京尼平苷和黄芩苷为指标成分，采用高效液相色谱法测定其含量，无法全面有效地控制龙胆泻肝丸的质量。本文参照相关文献[15-17]，结合笔者前期研究[18-20]，建立高效液相色谱法同时测定龙胆泻肝丸中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的含量，方法简便、快速、准确，可为提升龙胆泻肝丸的质量标准提供科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器岛津公司LC-20A型高效液相色谱仪(配备SIL-20AHT自动进样器，LC-20AT二元泵，CTO-20A柱温箱，SPD-20A紫外检测器，LC solution色谱工作站)；沃特世公司Waters SunFireTM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶)；昆山市超声仪器有限公司KQ-250DE型数控超声波清洗器(功率：250 W)；赛多利斯仪器有限公司CPA 225D型电子天平；天津市泰斯特仪器有限公司FW80型微型高速万能试样粉碎机；江苏新康医疗器械有限公司XK96-A快速混匀器；上海跃进医疗器械厂HH-B11型电热恒温培养箱。
1.2 试药乙腈和甲醇(流动相考察时用)为色谱纯(Thermo Fisher科技有限公司)；甲醇(提取溶剂)为分析纯(天津市巴斯夫化工有限公司)；磷酸为分析纯(天津市北方天医试剂厂)；纯净水(杭州娃哈哈集团有限公司)；龙胆苦苷对照品(批号110770-200611)、獐芽菜苦苷对照品(批号110785-201404)、京尼平苷对照品(批号110749-201316)、黄芩苷对照品(批号110715-201619)、汉黄芩苷对照品(批号112002-201501)、黄芩素对照品(批号111595-201607)和汉黄芩素对照品(批号111514-201605)均购自中国食品药品检定研究院，京尼平龙胆双糖苷对照品(批号141120)购自成都普菲德生物技术有限公司；以上对照品纯度均大于98%。龙胆泻肝丸购自北京同仁堂有限责任公司。
2 方法与结果 2.1 溶液的制备 2.1.1 对照品储备液取龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的对照品适量，精密称定，用甲醇配成质量浓度均为1.0 mg·mL-1的单一成分的溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液取龙胆泻肝丸本品6.0 g，研细，精密称取1.0 g，置于50 mL具塞锥形瓶中，加入甲醇-水(50: 50)50 mL，密塞，精密称量，超声(功率250 W，频率50 kHz)提取20 min，放冷至室温后再进行称量，并用甲醇-水(50: 50)补足减失的量，振摇均匀，用0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液，即得。
2.1.3 阴性样品溶液按处方量分别制备不含龙胆的阴性样品、不含黄芩的阴性样品、不含栀子的阴性样品，按“2.1.2”项方法操作，即得。
2.2 色谱条件采用Waters SunFireTM C18色谱柱(4.6 mm×250 mm，5 µm)，流动相为乙腈(A)-0.1%磷酸水(B)，梯度洗脱(0~6 min，10%A→15%A；6~7 min，15%A；7~10 min，15%A→16%A；10~15 min，16%A；15~20 min，16%A→30%A；20~35 min，30%A→33%A；35~38 min，33%A→38%A；38~60 min，38%A→48%A)，流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm，柱温为30 ℃，进样量20 μL。龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素用于含量测定的典型色谱图见图 1。
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1.京尼平龙胆双糖苷(gentiopicroside) 2.獐牙菜苦苷(swertiamarin) 3.京尼平苷(geniposide) 4.龙胆苦苷(genipingentiobioside) 5.黄芩苷(baicalin) 6.汉黄芩苷(wogonoside) 7.黄芩素(baicalein) 8.汉黄芩素(wogonin) 图 1 混合对照品(A)、样品(B)、不含龙胆的阴性样品(C)、不含栀子的阴性样品(D)、不含黄芩的阴性样品(E)的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A), sample(B), negative sample without Gentianae Radixet Rhizoma(C), negative sample without Gardeniae Fructus(D)andnegative sample without Scutellariae Radix(E) |
分别精密吸取“2.1.1”项下的各对照品储备液适量，置于同一5mL量瓶中，用甲醇-水(50: 50)配制成龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平龙胆双糖苷、汉黄芩苷质量浓度均为2.5、5、10、25、50和100 μg·mL-1，京尼平苷和黄芩苷质量浓度均为5、10、20、50、100和200 μg·mL-1，黄芩素和汉黄芩素质量浓度均为1.25、2.5、5、12.5、25和50 μg·mL-1的系列混合对照品溶液；取混合对照品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，按“2.2”项下条件依次进样测定色谱峰面积，以对照品质量浓度X(μg·mL-1)为横坐标，色谱峰面积积分值(Y)为纵坐标，进行线性回归，结果龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的回归方程：
Y=2.4×104X+1.9×104 r=0.999 7
Y=1.5×104X+1.3×104 r=0.999 6
Y=1.8×104X+3.3×104 r=0.999 6
Y=1.0×104X+8.2×103 r=0.999 6
Y=3.1×104X+6.2×104 r=0.999 5
Y=4.2×104X+3.8×104 r=0.999 6
Y=5.8×104X-7.4×103 r=0.999 8
Y=5.5×104X+1.2×104 r=0.999 8
上述8个成分质量浓度分别在2.5~100、2.5~100、5~200、2.5~100、5~200、2.5~100、1.25~50和1.25~50μg·mL-1范围内与峰面积呈良好的线性关系。
2.4 精密度试验精密吸取“2.3”项下制备的龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平龙胆双糖苷、汉黄芩苷质量浓度均为25 μg·mL-1，京尼平苷和黄芩苷质量浓度均为50 μg·mL-1，黄芩素和汉黄芩素质量浓度均为12.5 μg·mL-1的混合对照品溶液200μL，注入样品瓶中，置于样品架上。按上述色谱条件连续进样6次，记录峰面积。结果龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD(n=6)分别为0.17%、0.18%、0.22%、0.14%、0.072%、0.051%、0.54%、0.20%，表明仪器精密度良好。
2.5 稳定性试验取同一份的供试品溶液200μL，注入样品瓶中，置于样品架上，在室温下分别于供试品溶液制备后0、2、4、8、12和24 h进样测定，记录峰面积。结果龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素峰面积的RSD分别为0.33%、0.93%、0.50%、0.38%、1.9%、0.93%、2.7%、1.2%，表明供试品溶液在24h内稳定。
2.6 重复性试验取同一批龙胆泻肝丸(批号161202)样品6份，分别按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液；取供试品溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，进样测定，记录峰面积，计算待测成分的含量。结果龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量平均值(n=6)分别为1.707、0.530、3.783、1.697、7.370、1.258、0.518和0.297 mg·g-1，RSD分别为0.46%、1.4%、1.5%、0.15%、1.2%、1.3%、0.96%和1.2%，表明方法重复性良好。
2.7 加样回收率试验精密称取“2.6”项下已测知含量的龙胆泻肝丸样品粉末9份，每份0.5 g，精密称定，分别加入相当于样品中龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素含量的80%、100%、120%的对照品溶液适量，各3份。按“2.1.2”项下的方法制备供试溶液；取供试溶液200 μL，注入样品瓶中，置于样品架上，进样测定，计算龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的回收率和RSD，结果见表 1。
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表 1 龙胆泻肝丸中8个成分的回收率 Table 1 Recoveries of 8 components in LongdanXiegan pill |
精密称量6批次龙胆泻肝丸样品，按“2.1.2”项下的方法制备供试品溶液，进样20 μL，每个供试品溶液进样3次，记录峰面积，采用外标法计算龙胆苦苷、獐牙菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素、汉黄芩素的含量。6批样品测定结果见表 2。
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表 2 龙胆泻肝丸中8个成分的含量(mg·g-1) Table 2 The contents of 8 components in Longdan Xiegan pill |
分别考察了甲醇-0.1%磷酸溶液、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.2%磷酸溶液3种流动相体系。采用甲醇-0.1%磷酸溶液作为流动相时，京尼平苷和龙胆苦苷无法完全分离；采用乙腈-0.2%磷酸溶液作为流动相时，京尼平龙胆双糖苷与相邻色谱峰分离度不佳，且汉黄芩苷峰形较差；采用乙腈-0.1%磷酸溶液作为流动相时，能够获得较好的分离效果且其他杂质峰不影响样品的测定。
3.2 梯度洗脱程序的选择龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平苷和京尼平龙胆双糖苷的极性很相近，采用等度洗脱无法完全分离。因此，本文采用乙腈(A)-0.1%磷酸溶液(B)作为流动相，考察了不同的梯度洗脱条件。结果表明，采用本文所选择的梯度洗脱程序时，龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷能够很好的分离，且杂质峰无干扰。
3.3 检测波长的选择8种活性成分在254 nm下均有较强的紫外吸收，且峰形良好，综合考虑杂峰影响，基线平稳，最大吸收等因素，本试验最终选择254 nm作为检测波长。
3.4 柱温的选择本实验分别考察了柱温为30、35和40 ℃时龙胆苦苷、獐芽菜苦苷、京尼平苷、京尼平龙胆双糖苷、黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素和汉黄芩素的分离情况，结果表明，柱温为30 ℃时，上述8个物质能够实现较好的分离。
3.5 小结本实验研究所用的样品均为市售的不同批次的成方制剂，含量测定结果表明，6批次龙胆泻肝丸均符合中国药典2015年版规定，每1 g龙胆泻肝丸中龙胆苦苷成分含量均大于0.8 mg，京尼平苷含量均大于1.3 mg，黄芩苷含量均大于3.8 mg。本研究建立的HPLC方法重复性及稳定性好，专属性强，与中国药典2015年版相比，又增加了龙胆泻肝丸中5个有效成分的质量控制方法，可为龙胆泻肝丸的质量标准提升提供一定的参考。
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