2017, Vol. 37 
2. 江苏省食品药品监督检验研究院, 南京 210019;
3. 中国医药城, 泰州 225300;
4. 中国医学科学院北京协和医学院药物研究所, 北京 100050
2. Jiangsu Institute for Food and Drug Control, Nanjing 210019, China;
3. China Medical City, Taizhou 225300, China;
4. Institue of Materia Media, Chinese Academy of Medical Science & Peking Union Medical College, Beijing 100050, China
多西环素是以土霉素为原料研制成功的一种半合成广谱四环类抗生素[1]。其临床应用于敏感的革兰氏阳性球菌和革兰氏阴性杆菌所致的上呼吸道感染、慢性前列腺炎、盆腔炎、痤疮、衣原体感染和立克次体感染等[2-3]。其主要不良反应包括儿童牙齿变黄、胃肠道疾病、颅内压增高及过敏反应等[4]。
随着人们对药物安全性认识和要求的提高，药物杂质对临床用药安全性、疗效及产品质量的影响备受大家关注，欧美等国家制订了相关的指导原则[5]，我国近年来对有关物质的研究工作也提到前所未有的高度。对于盐酸多西环素，尽管中国药典2015年版二部对其原料药和制剂中的单个杂质及各杂质总和有限度要求[6]，但对设定单独控制杂质及其限度的合理性仍缺乏依据，更多的是统计学的层面进行。按照“杂质谱控制（impurity profiles）”理念[7]，即“针对药品中的每一个杂质，依据其生理活性制定相应的质控限度”的要求，作者采用在线脱盐LC-MS技术对代表性样品的杂质谱进行研究，发现制剂中既含有来源于原料的β-多西环素、美他环素和2-乙酰-2脱氨甲酰多西环素（杂质F），还含有降解4-表多西环素（杂质C），相关结构见图 1。为研究这些杂质的体外抗菌活性及对相关模型的活性，需要获得一定量杂质，其中杂质β-多西环素和美他环素可以从中国食品药品检定研究院购得，而杂质C和杂质F目前无法从市场获得；为此，利用制备液相色谱，分别获得一定量的多西环素杂质C、杂质F以供进行深入研究用[8-11]。本研究先采用纸片扩散法和常量肉汤二倍稀释法考察盐酸多西环素及主要有关物质的抗菌活性差异；采用中国仓鼠肺细胞（CHL）和斑马鱼动物胚胎模型评价盐酸多西环素与主要有关物质之间的相对毒性大小；依据上述结果，对现有质量标准中杂质控制的合理性进行评价，为制定最严谨的标准提供数据支撑。
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图 1 多西环素及各有关杂质的结构式[9] Figure 1 Chemical structures of doxycycline and related substances in doxycycline |
生物安全柜（苏净集团安泰公司）；隔水式恒温培养箱（上海一恒科技有限公司）；比浊仪（生物梅里埃中国有限公司）；控温摇床（上海智诚有限公司）；高压灭菌锅（SANYO公司）；Millipore纯化水仪（密理博公司）；DP2-BSW荧光显微镜（Olympus公司），ADMET Predictor软件（上海凡默谷信息技术有限公司）。
盐酸多西环素原料药（批号YD20140022CP），江苏联环药业股份有限公司；对照品多西环素（批号130485-201202）、美他环素（批号130499-200802）、β-多西环素（批号130405-200907），均购自中国食品药品检定研究院；盐酸多西环素原料药经100 ℃加热破坏后利用制备型液相色谱纯化自制杂质C（90.1%），盐酸多西环素原料药经减压浓缩后利用制备型液相色谱纯化自制杂质F（98.7%）。
中国仓鼠肺细胞，中国食品药品检定研究院；斑马鱼野生型AB和TU品系，中国医学科学院北京协和医学院医药生物技术研究所；水解酪蛋白琼脂培养基（MHA）（批号20140819），青岛海博生物技术有限公司；水解酪蛋白培养基（MHB）（批号20140814），青岛海博生物技术有限公司；大肠杆菌（ATCC25922，批号20111201），广东环凯微生物科技有限公司；金黄色葡萄球菌（ATCC29213，批号A0246B），广东环凯微生物科技有限公司。
2 方法与结果 2.1 盐酸多西环素及其主要有关物质的体外抗菌活性考察 2.1.1 纸片扩散法参考美国临床实验室标准化协会（CLSI）推荐的药敏试验方法[12]及Jennifer[13]等报道的方法，用MHB培养基分别配制质量浓度为1 024 μg·mL-1的美他环素、多西环素、土霉素、β-多西环素、杂质C及杂质F的溶液，精取上述供试品溶液20 μL分别浸润药敏纸片并晾干，将晾干后的各药敏纸片放于含有敏感细菌的固体培养基表面，37 ℃恒温培养箱培养18 h（如图 2），测定抑菌圈直径大小。除杂质F外，多西环素及其主要杂质“美他环素、土霉素、β-多西环素、杂质C”对大肠杆菌（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC29213）均有不同程度的抗菌活性，在所选浓度下各物质的体外抗菌活性由强至弱顺序为美他环素、多西环素、土霉素、杂质C。
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图 2 多西环素各有关物质的K-B纸片扩散法结果 Figure 2 The kirby-bauer disk diffusion results of related substances in doxycycline |
参照CLSI标准，将“2.1.1”项中各供试品溶液按二倍稀释法制备样品梯度组后分别加入敏感菌株，同时设立阳性对照（培养基+菌液）和阴性对照（仅培养基），所有试管于37 ℃恒温培养18 h。当阳性对照和阴性对照管均符合规定时，肉眼观察各供试品溶液及其稀释液试管的澄清情况，无细菌生长管对应的最低药物浓度即为最低抑菌浓度（MIC），主要有关物质的抗菌性能如表 1所示。进一步证实多西环素及主要有关物质的抗菌活性由强至弱依次为美他环素、多西环素、土霉素、杂质C、β-多西环素、杂质F。
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表 1 主要有关物质的抗菌性能 Table 1 Antibacterial properties of main related substance |
参照国家食品药品监督管理局“药物遗传毒性研究技术指导原则”[15]的相关要求试验。分别精密称取多西环素、美他环素、土霉素、β-多西环素、杂质C及杂质F，分别用适宜溶剂溶解（其中美他环素、土霉素、β-多西环素为二甲亚砜溶解，其余均为氯化钠注射液溶解），制备梯度浓度（0、12.5、25、50、100、200 μg·mL-1）的溶液，以梯度浓度的多西环素及主要有关物质染毒CHL细胞，设立代谢活化组[加S9mix（代谢活化剂混合物），细胞与药物接触4 h]和非活化组[不加S9mix，细胞与药物接触24 h]，观察细胞形态变化，根据活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶能使外源性MTT还原为水不溶性的蓝紫色结晶甲瓒并沉积在细胞中，而死细胞无此功能的特性，测定540 nm时的吸收度，一定细胞数范围内，MTT结晶形成的量与细胞数成正比，计算IC50以评估多西环素及主要有关物质的细胞毒性大小，试验结果见表 2。
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表 2 多西环素及主要有关物质对CHL的细胞毒性和遗传毒性结果 Table 2 The Cytotoxicity and genotoxicity of doxycycline and main related substance to Chinese hamster lung cells |
从表 2结果可以看出，根据IC50值，其毒性由大至小依次为多西环素、杂质F、土霉素、杂质C、β-多西环素、美他环素。
在上述试验结果的基础上，再选取多西环素及其5种杂质近IC50值作为受试浓度，在加与不加S9mix条件下分别染毒CHL细胞4 h和24 h，观察这些药物对染色体结构损伤的效应，结果显示：多西环素及主要有关物质对CHL细胞均有一定的细胞毒性，畸变率均小于5%，未见明显遗传毒性。
2.3 斑马鱼胚胎发育毒性比较斑马鱼动物模型对于药物毒性评价具有独特的优势，在对药物微量杂质的毒性评价方面，国内利用模式生物斑马鱼已经建立了多种毒性评价模型，通过评价杂质与药物活性成分（API）的相对毒性，评估药物杂质的危害性[16]。本研究利用药物胚胎毒性评价模型，评估多西环素及主要杂质之间的相对毒性。通过饲养液添加药物的给药途径，在标准环境下孵育，持续5 d，逐天观察受试动物胚胎发育情况，统计发育第3 d的畸形和死亡数/存活胚数。
如图 3-A所示，斑马鱼胚胎经质量浓度为300 μg·mL-1的多西环素作用72 h全部死亡；质量浓度为500 μg·mL-1时，胚胎在发育到48 h已全部死亡，所检测浓度范围内的毒性以致死为主。
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A.多西环素（doxycline）B.β-多西环素（β-epidoxycycline）C.土霉素（oxytetracycline）D.美他环素（metacycline）E.杂质C（impurity C）F.杂质F（impurity F） 图 3 多西环素及主要有关物质致畸及致死结果 Figure 3 The teratogenesis and lethality results of main related substances and doxycycline |
如图 3-B所示，斑马鱼胚胎经质量浓度为300 μg·mL-1的β-多西环素作用120 h未见明显畸形，只是表现为发育略滞后；质量浓度为500 μg·mL-1时，胚胎至72 h几乎全部死亡，毒性以致死为主。
如图 3-C所示，斑马鱼胚胎经质量浓度为500 μg·mL-1的土霉素作用72 h后畸形率和死亡率均显著增加，至120 h几乎全部死亡。
如图 3-D所示，斑马鱼胚胎经质量浓度为100 μg·mL-1的美他环素作用后胚胎畸形率近40%，质量浓度为300 μg·mL-1时畸形率近90%；质量浓度为500 μg·mL-1时，胚胎72 h的死亡率近100%。
如图 3-E所示，斑马鱼胚胎经质量浓度为59 μg·mL-1的杂质C作用后即出现一定程度的畸形和死亡现象，畸形率与浓度正相关，质量浓度为300 μg·mL-1时，胚胎在72 h的死亡率达到100%。
如图 3-F所示，斑马鱼胚胎经质量浓度为100 μg·mL-1的杂质F作用后略有畸形，质量浓度为500 μg·mL-1和700 μg·mL-1时的畸形率和致死率相当，表明其致畸范围较宽，两浓度持续作用120 h后均全部死亡。
综合图 3知，多西环素和β-多西环素未见明显致畸作用，杂质C致畸作用最强，美他环素次之，杂质F与土霉素的致畸作用相当且弱于美他环素；杂质C致死作用较强，其致死作用大于等于多西环素，β-多西环素与美他环素致死作用相当且弱于多西环素，土霉素的致死作用大于等于杂质F且弱于美他环素。
各有关物质致胚胎畸形的表型相似，只是严重程度略有差异，提示其毒性作用机理可能相似。致畸表型包括身体变短和弯曲、体表颜色浅，头和眼小、腹部大而圆、卵黄囊及其延伸结构变形、心脏缺陷及无正常胚动等（如图 4）。
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A.正常表型（normal phenotype）B~H.致畸表型（teratogenesisphenotyte） 图 4 各主要有关物质致畸表型 Figure 4 The teratogenesis phenotype of main related substances of doxycycline |
细菌对抗生素敏感性试验在控制细菌耐药性及合理使用抗生素等方面发挥着重要作用。根据药敏结果既可对抑菌效果进行定性，又可预测其临床效果，进而实现个体化治疗等[17]。常量肉汤稀释结果显示多西环素各有关物质对大肠杆菌（ATCC25922）和金黄色葡萄球菌（ATCC29213）均有不同程度的抗菌作用，纸片扩散法结果进一步证实各有关物质间的抗菌活性差异，杂质C（热降解杂质）、杂质F及β-多西环素的抗菌活性均明显低于主成分多西环素。分析多西环素及有关物质结构，均具有相同的十二氢化并四苯基本骨架结构，杂质C是多西环素的4位差向异构体，β-多西环素是多西环素的6位差向异构体，杂质F是多西环素2位碳脱酰胺产物。杂质C活性降低是由于4位碳上的二甲胺基形成空间位阻[18-19]，杂质F活性降低是由于缺失与细菌核糖体蛋白30S亚基结合所必需的酰胺基[20]，根据结构特点推测β-多西环素活性降低亦有可能是空间位阻变化的原因。
斑马鱼是生命科学领域常用3种模式动物之一，因具有饲养成本低，实验周期短，与哺乳动物相似的生物结构及生理功能等优点而用于毒理学研究[21-22]。国内已有专业机构利用斑马鱼胚胎毒性评价了多种药物杂质[23]。在本研究中各有关物质的致畸性依次为杂质C、美他环素、杂质F/土霉素；致死作用依次为杂质C、β-多西环素/美他环素、杂质F，该结果与四环素差向异构体具有较强毒性的报道相呼应[24]。目前对四环类差向异构体的毒性机制研究甚少，Mcfarland[25]报道认为化合物毒性的差异在于其LogP、偶极性-极化性和给出质子能力的差异，遗憾的是笔者采用ADMET预测软件未发现各有关物质结构与毒性差异的规律，仍有待后续深入研究。
参考国内外现行药典对盐酸多西环素片有关物质的规定（美他环素和β-多西环素均不得过2.0%，其他单杂不得过1.0%，各杂质总和不得过5.0%），结合2014年度国家评价性抽验的153批次国产盐酸多西环素片有关物质统计数据[美他环素（0.06%~0.76%）、β-多西环素（0.45%~1.74%）、杂质F（0.30%~0.98%）及杂质C（0.09%~0.96%），各杂质总和1.43%~3.43%]，根据斑马鱼毒性实验与定量结构性质理论[26]以及本研究的抗菌活性和毒性结果，建议在制定盐酸多西环素片质量标准时，美他环素限度不得过1.0%，β-多西环素不得过2.0%，杂质C不得过1.0%，杂质F不得过0.5%，总杂不得过4.0%。鉴于杂质C和杂质F对照品获得比较困难，研究过程中，分别测定了相关杂质与主成分多西环素之间的相对校正因子，结果多西环素、β-多西环素、杂质F、美他环素、杂质C相对校正因子（n=3）分别为1.00、1.17、1.05、0.78、0.98，均在0.8~1.2之间，因此均可采用不加校正因子主成分自身对照法，对于降解杂质C采用溶液加热破坏的方式获得杂质进行定位[10]，杂质F则可以根据相对保留时间[11]，其余几个杂质则可以借助杂质对照品进行定位，一方面最大程度地节约购买杂质对照品所需昂贵费用，另一方面可避免因购买国外杂质对照品所需周期长乃至无相应对照品提供而影响产品质量研究的尴尬局面。
【致谢：江苏省食品药品监督检验研究院药理室在细胞毒性实验过程中给予的帮助。】
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