2017, Vol. 37 
2. 川北医学院附属医院药剂科, 南充 637000
2. Department of Pharmacy, Affiliated Hospital of North Sichuan Medical University, Nanchong 637000, China
佛手为芸香科植物佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）的干燥果实，具有疏肝理气、和胃止痛、燥湿化痰的作用[1]，主要包括黄酮[2-3]、挥发油[4-6]和香豆素[7-8]等类化学成分。中国药典以橙皮苷的含量作为质量控制指标。有研究报道，佛手药材中含有丰富的5，7-二甲氧基香豆素[9]。还有研究表明[10-12]，柚皮苷、6，7-二甲氧基香豆素及佛手柑内酯为具有药物活性的成分。黄酮和香豆素类[13-14]化合物有抗菌、抗炎、抗肿瘤、抗氧化等生物学活性，但对佛手药材中柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯等含量测定方法未见报道。本研究建立了高效液相色谱（HPLC）法同时测定佛手药材中柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的含量，可为制定该药材的质量控制提供参考。
1 仪器与试药 1.1 仪器安捷伦公司Agilent-1260型高效液相色谱仪，包括四元泵，在线脱气机，紫外检测器等；北京迪马欧泰科技发展中心Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；梅特勒公司Mettle AE 240十万分之一电子天平；昆山市超声仪器有限公司KQ-500型超声波清洗器（功率500 W，频率40 kHz）。
1.2 试药佛手药材，市售，经鉴定其来源于芸香科植物佛手（Citrus medica L.var.sarcodactylis Swingle）；对照品6，7-二甲氧基香豆素（批号140910，纯度 > 98%）、5，7-二甲氧基香豆素（批号10150339，纯度 > 98%）和佛手柑内酯（批号151230，纯度 > 98%）均购于江西康测科技有限公司，柚皮苷和橙皮苷为自制（1H-和13C-NMR、ESI-MS鉴定，含量采用HPLC峰面积归一化法计算不低于98%）；乙腈为HPLC级，水为纯水（Millipore水纯化仪自制），其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果 2.1 混合对照品溶液的制备分别精密称取减压干燥至恒重的对照品柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯适量，置同一10 mL量瓶中，加甲醇溶解并定容至刻度，摇匀，即得上述5个对照品质量浓度分别为9.33、40.64、8.385、80.64、4.32 μg·mL-1的混合对照品溶液。
2.2 供试品溶液的制备[1]取佛手粉末（过5号筛）约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，密塞，称量，超声（功率500 W，频率40 kHz）提取1.5 h，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，过0.45 μm滤膜，取续滤液作为供试品溶液。
2.3 色谱条件色谱柱：Diamonsil C18（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%醋酸水（B），二元梯度洗脱（0~15 min，18%A→26%A；15~18 min，26%A→49%A；18~25 min，49%A；25~28 min，49%A→100%A）；流速：1.0 mL·min-1，波长切换（0~15 min，在283 nm波长下检测柚皮苷和橙皮苷；15~28 min，在320 nm波长下检测6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯）；柱温：30 ℃；进样量：10 μL。色谱图见图 1。
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1.柚皮苷（naringin）2.橙皮苷（hesperidin）3. 6，7-二甲氧基香豆素（6，7-dimethoxycoumarin）4. 5，7-二甲氧基香豆素（5，7-dimethoxycoumarin）5.佛手柑内酯（bergapten） 图 1 混合对照品（A）和样品（B）的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of mixed reference substances(A)and sample(B) |
因样品中5个成分的含量较低，故对其定量限和检测限进行了考察。取“2.1”项下混合对照品溶液进行稀释，按上述色谱条件进样测定；结果当S/N=10时，柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的定量限分别为1.78、2.37、1.81、0.79、0.96 ng；当S/N=3时，检测限分别为0.53、0.71、0.54、0.23、0.29 ng。
2.5 线性关系考察取“2.1”项下混合对照品溶液，按上述色谱条件分别进样1、4、8、10、16、20 μL进行测定，以对照品的量X（ng）为横坐标，色谱峰峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程。其线性范围、回归方程和相关系数（n=6）结果见表 1。
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表 1 各成分的线性范围、回归方程、相关系数 Table 1 Linear range, regression equation and correlation coefficient of components |
精密吸取“2.1”项下的混合对照品溶液10 μL，在上述相同色谱条件下连续进样6次，测定峰面积。结果柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯峰面积的RSD分别为0.65%、0.45%、0.89%、0.39%、0.48%，表明精密度良好。
2.7 重复性试验称取佛手样品（样品编号4）粉末共5份，每份约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按上述色谱条件测定，计算含量。结果柚皮苷的平均含量为0.045%，RSD为1.9%；橙皮苷的平均含量为0.075%，RSD为1.9%；6，7-二甲氧基香豆素的平均含量为0.020%，RSD为2.4%；5，7-二甲氧基香豆素的平均含量为0.119%，RSD为1.8%；佛手柑内酯的平均含量为0.005%，RSD为2.5%；表明重复性良好。
2.8 稳定性试验取佛手药材粉末约0.5 g，精密称定，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，精密吸取供试品溶液10 μL，分别按照上述色谱条件在0、2、4、6、8、10、12 h注入液相色谱仪，测定峰面积。结果柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯峰面积的RSD分别为2.4%、2.2%、1.9%、2.1%、2.4%，表明供试品溶液在室温下12 h内稳定。
2.9 加样回收率试验精密称取已测含量（柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的含量分别为0.046%、0.073%、0.021%、0.114%、0.005%）的4号佛手样品共6份，每份约0.25 g，分别精密加入混合对照品溶液（柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的质量浓度分别为0.115、0.1825、0.0525、0.285、0.0125 mg· mL-1）1 mL，按“2.2”项下方法制备供试溶液，测得柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的平均回收率（n=6）分别为95.5%、98.9%、95.8%、100.2%、97.7%，RSD分别为3.0%、2.6%、1.8%、2.6%、3.0%。
2.10 样品含量测定取11批佛手样品的粉末各0.5 g，精密称定，分别按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条测定，采用回归方程计算含量，结果见表 2。
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表 2 不同产地佛手中柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯含量（%，n=3） Table 2 The contents of naringin, hesperidin, 6, 7-dimethoxycoumarin, 5, 7-dimethoxycoumarin and bergapten in Fructus Citris Sarcodactylis from different habitats |
有关佛手含量测定的文献报道很多[2, 9, 15]，但迄今未见对其化学成分柚皮苷、6，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯含量测定的报道。本文在对佛手药材中柚皮苷和橙皮苷进行离体药效研究中发现，其累积浓度分别为4.99×10-6~3.99×10-3和0.550~1.38 mmol· L-1时，对豚鼠离体气管平滑肌有明显的舒张作用，说明柚皮苷和橙皮苷可能是与佛手功效相吻合的药效成分。后期继续探索香豆素类成分的相关药理作用，进一步阐明其药效物质基础。药材中多指标同时检测的快速高效分析方法会成为今后研究的热点，故本文选择对佛手的多种成分进行含量测定。
3.2 检测波长的选择取柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的对照品溶液，置UV-1750紫外可见分光光度计下，于200~700 nm波长范围内进行扫描，结果柚皮苷和柚皮苷在283 nm处有最大吸收，6，7-二甲氧基香豆素在326 nm处有最大吸收，5，7-二甲氧基香豆素在324 nm处有最大吸收，佛手柑内酯在310处有最大吸收。因此，将检测波长设定为0~15 min时283 nm，15~28 min时320 nm。
3.3 流动相的选择佛手中所含成分复杂，本文分析的5个成分极性相差不同，等度洗脱难以实现同时分离，故采用梯度洗脱的方法。试验考察了多种流动相系统（甲醇-0.1%磷酸水、乙腈-0.1%磷酸水、甲醇-0.1%醋酸水、乙腈-0.1%醋酸水），结果显示，乙腈-0.1%醋酸水能达到分离度的要求，分离时间合适，最后确定流动相为乙腈（A）-0.1%醋酸水（B），二元梯度洗脱（0~15 min，18%A→26%A；15~18 min，26%A→49%A；18~25 min，49%A；25~28 min，49%A→100%A）。
3.4 提取条件的选择本试验考察了超声提取法和水浴加热回流法在不同提取时间的提取效果，结果表明，超声提取和水浴加热回流提取均有效，但是超声提取操作简便，综合考虑，本实验采用超声方法提取。
3.5 不同产地样品的含量测定通过对不同产地佛手药材中柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基番豆素和佛手柑内酯进行含量测定，结果表明，不同产地各成分含量差距较大，其中，广东佛手（5号样品）中橙皮苷的含量低于0.03%未达到《中国药典》2015年版的规定，浙江、福建、云南等的佛手虽然检测到含有6，7-二甲氧基香豆素，但低于定量限。
3.6 小结本试验采用HPLC法测定不同产地的佛手药材中柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的含量，方法操作简便，准确可靠，重复性好，可快速准确测定佛手药材中柚皮苷、橙皮苷、6，7-二甲氧基香豆素、5，7-二甲氧基香豆素和佛手柑内酯的含量。
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