2017, Vol. 37 
蓝芩口服液由板蓝根、黄芩、栀子、黄柏、胖大海5味中药组成, 具有清热解毒、利咽消肿的功效, 对于急性咽炎、肺胃湿热证所致的咽痛、咽干、咽部灼热有较好的疗效, 临床上主要用于手足口病[1-3]、咽峡炎[4-5]、咽炎[6-7]、扁桃体炎[7-8]和腮腺炎[9]等疾病的治疗。目前, 对蓝芩口服液成分的测定主要针对黄酮类化合物黄芩苷[10-12]、萜苷类化合物栀子苷[12-14]、酚酸类化合物绿原酸[14]及生物碱类化合物小檗碱[10], 对核苷类成分的含量测定未见报道。核苷类成分是板蓝根药材的水溶性成分, 具有抗病毒、解热及活血的作用, 其含量高低直接影响板蓝根制剂的质量和疗效[15-16]。本研究旨在建立一种选择性好、灵敏度高、简便快捷的UPLC-MS/MS方法, 同时测定蓝芩口服液中鸟苷、腺苷和胞苷的含量, 较为系统地研究该制剂中核苷类成分的质量指标, 为全面控制蓝芩口服液的质量提供科学依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1290高效液相色谱仪串联Agilent 6430 Triple Quad LC/MS三重四极杆质谱仪(Agilent公司, 使用MassHunter工作站)；CPA225D电子天平(Satorius公司)；LEGEND MICRO-17R冷冻离心机(Thermo公司)；Milli-Q超纯水机(Millipore公司)。
1.2 试药对照品鸟苷(批号13091006, 纯度99.3%)、腺苷(批号13081813, 纯度99.2%)、胞苷(批号13062509, 纯度98.9%)均购自成都普瑞法科技开发有限公司；对照品替硝唑(内标, 批号100336-200703, 纯度99.8%)购自中国食品药品检定研究院；蓝芩口服液(批号15062522、16042221、16101022, 规格为每支10 mL)由扬子江药业集团有限公司生产；甲醇、甲酸为色谱纯；水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Agilent ZORBAX SB C18(2.1 mm×150 mm, 5 μm)色谱柱, 以甲醇-0.1%甲酸水溶液为流动相, 梯度洗脱(0.0~2.4 min, 20:80；2.5~4.9 min, 90:10；5.0~6.0 min, 20:80), 流速0.2 mL·min-1, 柱温35 ℃, 进样量2 μL。
2.2 质谱条件采用电喷雾离子源(ESI), 正离子模式, 多反应离子监测(MRM), 毛细管电压4 kV, 干燥气温度350 ℃, 干燥气流量10 000 mL·min-1, 雾化器压力137.9 kPa, 裂解电压100 V, 碰撞电压10 V；选择离子通道:鸟苷m/z 284.1→m/z 152.1, 腺苷m/z 268.0→m/z 136.0, 胞苷m/z 244.1→m/z 112.1, 替硝唑m/z 248.1→m/z 121.1。
2.3 混合对照品溶液及内标溶液的制备精密称取鸟苷对照品10.44 mg, 腺苷对照品9.04 mg和胞苷对照品9.18 mg, 各置于10 mL量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 作为对照品储备液。分别取上述各对照品储备液适量, 置于同一10 mL量瓶中, 用20%甲醇水溶液稀释至刻度, 配制成含鸟苷100 ng·mL-1, 腺苷150 ng·mL-1和胞苷200 ng·mL-1的混合对照品溶液A；精密吸取混合对照品溶液A 1.0、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mL, 分别置于10mL量瓶中, 用20%甲醇水溶液稀释至刻度, 得到含鸟苷10、20、40、60、80、100 ng·mL-1, 腺苷15、30、60、90、120、150 ng·mL-1和胞苷20、40、80、120、160、200 ng·mL-1的6个浓度的混合对照品溶液, 用于线性关系考察。另取上述各对照品储备液适量, 置于同一10 mL量瓶中, 用20%甲醇水溶液稀释至刻度, 配制成含鸟苷37.58 μg·mL-1, 腺苷88.59 μg·mL-1和胞苷50.49 μg·mL-1的高浓度混合对照品溶液B, 用于加样回收率试验。
另精密称取替硝唑对照品10.12 mg, 置于10 mL量瓶中, 用甲醇溶解并稀释至刻度, 作为内标储备液；取内标储备液适量, 用20%甲醇水溶液稀释至100 ng·mL-1, 作为内标溶液。
2.4 供试品溶液的制备精密吸取蓝芩口服液0.05 mL, 置于1 mL量瓶中, 用20%甲醇水溶液稀释至刻度, 摇匀后转移至1.5 mL塑料离心管中, 12 000 r·min-1离心5 min, 吸取上清液0.1 mL置于10 mL量瓶中, 用20%甲醇水溶液稀释至刻度, 摇匀即得(即蓝芩口服液稀释2 000倍)。
2.5 方法学考察 2.5.1 系统适用性试验精密量取含鸟苷、腺苷、胞苷分别为20、30、40 ng·mL-1的混合对照品溶液和供试品溶液各0.1 mL, 分别加入内标溶液0.1 mL, 混匀, 按“2.1”和“2.2”项下条件进样2 μL进行分析, 记录UPLC-MS/MS图。在本文实验条件下, 鸟苷和腺苷的保留时间为2.25 min, 胞苷为1.83 min, 内标替硝唑为4.80 min。分析物及内标互不干扰, 峰形良好, 基线平稳, 信噪比均大于120, 见图 1。
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1.鸟苷(guanosine) 2.腺苷(adenosine) 3.替硝唑(内标) [tinidazole(internal standard)] 4.胞苷(cytidine) 图 1 20%甲醇水溶液(A)、混合对照品(B)、蓝芩口服液(C)的UPLC-MS/MS图 Figure 1 UPLC-MS/MS Chromatograms of 20% methanol solution(A), mixed reference substances(B)and Lanqin oral liquid(C) |
精密吸取“2.3”项下6个浓度的混合对照品溶液各0.1 mL, 分别加入内标溶液0.1 mL, 混匀, 按“2.1”和“2.2”项下条件分析测定, 以对照品质量浓度(X)为横坐标, 分析物峰面积与内标峰面积的比值(Y)为纵坐标, 绘制标准曲线, 得鸟苷、腺苷、胞苷线性回归方程:
Y=0.012 6X+0.013 0 r=0.999 9
Y=0.028 0X-0.003 9 r=0.999 9
Y=0.010 8X+0.006 9 r=1.000
结果表明, 鸟苷、腺苷、胞苷质量浓度分别在10~100、15~150、20~200 ng·mL-1范围内, 线性关系良好。
2.5.3 精密度试验精密吸取含鸟苷、腺苷、胞苷分别为20、30、40 ng·mL-1的混合对照品溶液0.1 mL, 加入内标溶液0.1 mL, 混匀, 按“2.1”和“2.2”项下条件连续进样5次, 鸟苷、腺苷、胞苷与内标的峰面积比值的RSD分别为0.74%、1.6%、0.77%, 表明仪器具有良好的精密度。
2.5.4 重复性试验取同一批号蓝芩口服液(批号16042221), 按“2.4”项下方法制备供试品溶液5份, 各取0.1 mL, 分别加入内标溶液0.1 mL, 混匀, 按“2.1”和“2.2”项下条件分析测定, 测得蓝芩口服液中鸟苷、腺苷、胞苷的平均含量分别为38.02、88.68、51.03 μg·mL-1, RSD分别为2.8%、2.2%、1.1%, 表明本方法具有良好的重复性。
2.5.5 稳定性试验精密吸取同一供试品溶液(批号16042221)0.1 mL, 加入内标溶液0.1 mL, 混匀, 分别于0、2、4、8、24 h进行测定, 结果鸟苷、腺苷、胞苷与内标的峰面积比值的RSD分别为3.2%、2.7%、2.6%, 表明供试品溶液在24 h内稳定。
2.5.6 加样回收率试验精密吸取已测知含量的同一批号蓝芩口服液(批号16042221)0.05 mL共9份, 平均分成3组, 分别置于1 mL量瓶中, 每组分别加入“2.3”项下高浓度混合对照品溶液B 0.04、0.05、0.06 mL, 按“2.4”项下方法制备供试溶液, 按“2.1”和“2.2”项下条件分析测定, 结果见表 1。
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表 1 蓝芩口服液加样回收率试验结果(n=3) Table 1 Recoveriesfor three kinds of nucleosides in Lanqin oral liquid |
分别取3个批次的蓝芩口服液, 每个批次3份, 分别按“2.4”项下方法制备供试品溶液, 各取0.1 mL, 加入内标溶液0.1 mL, 混匀, 按“2.1”和“2.2”项下条件分析测定, 计算鸟苷、腺苷和胞苷的含量, 结果见表 2。
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表 2 蓝芩口服液中鸟苷、腺苷和胞苷的含量测定结果(µg·mL-1, n=3) Table 2 The contents of three kinds of nucleosides in Lanqin oral liquid |
据文献报道, 对蓝芩口服液的质量控制大多采用高效液相色谱法测定黄芩苷和栀子苷[10-14]。方中其他活性成分的含量测定报道较少, 对于核苷类成分未见报道。核苷类成分是板蓝根的活性成分, 具有清热解毒的作用。本实验采用UPLC-MS/MS法, 对蓝芩口服液中鸟苷、胞苷和腺苷同时定量, 该方法方便可靠, 专属性强, 灵敏度高, 为蓝芩口服液质量标准的提高提供了实验依据。
由于质谱检测在灵敏度和专属性上的优势, 使得本实验供试品溶液的制备方法非常简单, 将蓝芩口服液用20%甲醇水溶液稀释后离心取上清液即可。本实验先后考察了甲醇-水溶液、乙腈-水溶液、甲醇-0.1%甲酸水溶液流动相, 从分离情况综合考虑, 采用甲醇-0.1%甲酸水溶液梯度洗脱效果比较理想。
本文所测定的蓝芩口服液中, 腺苷和胞苷的含量在3个批次间比较稳定, 而鸟苷波动较大, 分别为28.05、38.37和34.63 µg·mL-1。这可能是不同产地不同批次的板蓝根药材差别较大所致[15-16], 这也说明了增加核苷类成分作为蓝芩口服液质量指标的必要性。
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