2017, Vol. 37 
随着医疗技术和经济水平的提高，血小板制剂的临床需求快速增长。目前我国临床上多采用机采血小板，其采集量不能满足临床需求的快速增长，因此利用全血分离制备浓缩血小板来补充临床需求势在必行[1]。由于血小板本身的生物特性复杂，其离体保存时间短，贮存血小板的血袋透气性差或者增塑剂溶出量超标均有可能导致血小板功能丧失[2]。因此，对于血小板贮存袋的研究主要集中在减少增塑剂的溶出、降低增塑剂的毒性以及提高血袋透气性[3]。
丁酰柠檬酸三正己酯（BTHC）是目前市场上常用且认可度较高的一种用于聚氯乙烯（PVC）血小板液保存袋的增塑剂[4]。相比于邻苯二甲酸二（2-乙基）己酯（diethylhexyl phthalate，DEHP）增塑的PVC血袋，BTHC-PVC血袋具有更高的透气性，可延长血小板的贮存时间[5-6]。不仅如此，BTHC在人体内的代谢产物为丁酸、己醇和柠檬酸[7]，因此BTHC毒性较低且无明显毒副作用，安全使用剂量较高[8]，目前已广泛应用于血小板贮存袋。四川双陆医疗器械有限公司开发了一次性使用去白细胞血小板贮存袋，目的在于对浓缩血小板进行汇集，过滤去除白细胞，然后对血小板进行保存，其中血小板贮存袋采用BTHC增塑的PVC材料。根据国家对于医疗器械产品助剂含量控制要求的有关规定，需要对其增塑剂溶出进行风险评估。
对于与BTHC结构十分相似的乙酰柠檬酸三丁酯（acetyl tributyl citrate，ATBC）柠檬酸类增塑剂溶出量测定的文献报道较多，方法包括气相色谱-质谱联用（gas chromatography-mass spectrometry，GC-MS）[7-10]，高效液相色谱法（HPLC）[11-12]与气相色谱法（gas chromatography，GC）[13]，但是国内外尚无测定BTHC在血小板制剂中溶出量的报道。因此，本文以四川双陆生产的血小板贮存袋作为研究对象，建立了HPLC定量检测混合浓缩血小板保存过程中BTHC溶出量的测定方法，从而为评估BTHC在临床使用中的溶出风险提供依据。
1 仪器与材料 1.1 仪器高效液相色谱（Agilent 1260，美国Agilent公司），SunFireTM C18色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶，超纯硅胶填料；5.0 µm，4.6 mm×150 mm，美国Waters公司），PC900h型血小板保存箱（Helmer，美国），恒温水浴（ED，德国Julabo），紫外/可见光分光光度计（美国Beckman，DU800）。一次性使用去白细胞血小板贮存袋（四川双陆医疗器械有限公司，规格型号：KF-WFP-II/1000 mL，批号：160601）。
1.2 材料乙腈、甲醇（色谱纯，赛默飞世尔科技（中国）有限公司），BTHC对照品（四川双陆医疗器械有限公司提供，纯度98%），浓缩血小板（成都市血液中心提供）。
2 方法与结果 2.1 试验设计按照使用说明书用一次性使用去白细胞血小板贮存袋制备滤除白细胞的混合浓缩血小板，由BTHC增塑的血小板贮存袋保存（血小板保存箱，22±2 ℃，水平振荡），分别于保存第1天、第3天、第5天和第7天取样，用乙腈处理血小板样品，用高效液相色谱仪（HPLC）测定血小板中增塑剂BTHC的含量，以此计算增塑剂BTHC的溶出量。
2.2 BTHC特征吸收波长的选择精密称取BTHC对照品0.010 04 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到浓度为1.004 mg·mL-1的对照品储备液。用紫外/可见光分光光度计在200~300 nm范围内进行全波长扫描，根据吸收光谱曲线确定HPLC检测波长为226 nm，吸收光谱见图 1。
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图 1 BTHC吸收光谱 Figure 1 The absorbance spectrum of BTHC |
色谱柱：SunFireTM C18柱（4.6 mm×150 mm，5.0 µm，填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；柱温：30±5 ℃；流动相：乙腈-水（90：10）；流速：1 mL ·min-1；进样量：20 µL；保留时间0~25 min；检测器：紫外/可见光检测器：波长226 nm；BTHC标准品的保留时间为2.70 min，色谱图见图 2。
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图 2 BTHC对照品液相色谱图 Figure 2 HPLC spectrum of BTHC standard |
精密称取BTHC对照品0.010 04 g，用甲醇溶解并定容至10 mL，得到浓度为1.004 mg·mL-1的对照品储备液。取对照品储备液用甲醇逐级稀释，得到10、25、50、100、251、502 µg·mL-1浓度的系列对照品溶液，按照“2.3”条件进行测定，以峰面积为纵坐标，BTHC浓度为横坐标绘制BTHC标准曲线，得到线性回归方程：
Y = 0.358 5X +0.070 8 r=0.999 9
表明BTHC在10 µg·mL-1~502 µg·mL-1浓度范围内线性关系良好。
2.5 灵敏度试验取BTHC对照品储备液，用甲醇逐级稀释，得到不同浓度的对照品溶液，按照“2.3”条件进行定量测定，以信噪比不低于3确定检测限。当BTHC质量浓度为2 µg·mL-1时，信噪比S/N=4.2。由此确定在“2.3”条件下BTHC的检测限为0.04 µg。
2.6 精密度试验取质量浓度为502 µg·mL-1、100 µg·mL-1与25 µg·mL-1的BTHC对照品溶液，按照“2.2”条件分别连续定量测定5次，得到峰面积的变异系数RSD%分别为3.3%，4.3%和4.5%，均小于5%，表明此方法具有较好的仪器精密度。
2.7 准确度试验精确吸取“2.8.2”血小板贮存袋中保存第5天的混合浓缩血小板1 mL，共取4份，1份为空白，其他3份分别加入由甲醇配制的浓度为4 016 µg·mL-1、2 008 µg·mL-1和1 004 µg·mL-1的BTHC对照品溶液50 µL混匀，然后按照“2.8.2”方法制备供试液。按照“2.3”条件进行测定，根据标准曲线计算供试液中BTHC的浓度，供试液色谱图见图 3。计算得到回收率为98.6%±8.4%，以此计算血小板贮存袋保存混合浓缩血小板时BTHC的溶出量。
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a.未加标（blank）b.加标（added）50.2 µg c.加标（added）100.4 µg d.加标（added）200.8 µg 图 3 回收率试验液相色谱图 Figure 3 HPLC spectrums of recovery test |
浓缩血小板由成都市血液中心提供。选择符合国家献血标准的健康献血者，按《血站技术操作规程》采集全血400 mL，采用富血小板血浆法制备浓缩血小板（PC，每袋60~70 mL），质量均符合《全血及成分血质量要求》（GB 18469—2012）。将5~6袋ABO同型的浓缩血小板通过无菌接管机汇集得到一个治疗剂量的混合浓缩血小板，转移至一次性使用去白细胞血小板贮存袋产品的汇集袋中，血小板在重力作用下流经去白细胞滤器，过滤后的血小板进入血小板贮存袋中，排气后热合封闭。试验共完成5例。血小板均置于血小板保存箱，在20~24 ℃、振荡频率60次·min-1、振幅5 cm条件下振荡保存。分别在血小板保存第1、3、5、7天从血小板贮存袋中取样测定BTHC含量。
2.8.2 BTHC溶出量的测定取“2.8.1”保存的血小板样品，每例取血小板1 mL作为供试液，与乙腈按1:1混合[14]，涡旋震荡30 s后5 000 r·min-1离心10 min，上清液体积为1.5 mL作为样品检测液。按照“2.3”色谱条件检测，样品检测液色谱图见图 4a~d。根据标准曲线计算得到不同保存时间检测液浓度，从而计算血小板液BTHC浓度以及1个治疗剂量（U）的混和浓缩血小板中所含BTHC总量，结果见表 1。计算公式如下，
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a.保存第1天（stored at the 1st day）b.保存第3天（stored at the 3rd day）c.保存第5天（stored at the 5th day）d.保存第7天（stored at the 7th day） 图 4 样品供试液液相色谱图 Figure 4 HPLC spectrums of samples No. 1 |
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表 1 BTHC溶出量实验结果（n=5） Table 1 The migration of BTHC from platelet storage bags |
血小板液BTHC浓度（µg ·mL-1）=检测液浓度×上清液体积（1.5 mL）÷供试液体积（1 mL）÷回收率（98.6%）
BTHC溶出总量（mg·U-1）=血小板液BTHC浓度（µg ·mL-1）×浓缩血小板液体积（mL·U-1）÷1 000
3 讨论与小结 3.1 关于BTHC测定的方法学结果显示，本研究所用方法在10~502 µg·mL-1的BTHC浓度范围保持良好的线性关系，准确度高、精确度好。试验证明，用乙腈去除血小板悬液中的蛋白及杂质、用HPLC分析BTHC含量的方法不仅操作简单、分析快速，且回收率高，结果可靠，可以用于测定BTHC在血小板悬液中的溶出量。
3.2 血小板贮存袋增塑剂BTHC风险评估血小板贮存袋原材料为聚氯乙烯（PVC），其使用的增塑剂为BTHC。在正常的临床使用时，材料中的部分增塑剂可迁移至血小板悬液中并随血小板输注而进入体内[15]。通过比较血小板保存过程中BTHC的溶出量以及人体静脉途径摄入BTHC的TI值，对BTHC在血小板中的溶出进行风险分析。
据文献报告[16]，将BTHC按5、50和500 mg·kgbw-1·day-1的剂量静脉给予成年大鼠，持续28 d。在500 mg·kg bw-1·day-1剂量下，未观察到体重发生变化，但是观察到肝和脾的重量有适中增加，同时显示一些血液参数在统计学上的显著性变化，即血红蛋白、平均红细胞体积（MCV）和血小板水平下降，同时纤维蛋白原和网织红细胞水平增加。在两组低剂量中未观察到任何变化，因此可以确定静脉注射途径的无作用剂量（NOEL）为50 mg·kg bw-1·day-1。依据国标GB/T16886.17—2005《医疗器械生物学评价第17部分：可沥滤物允许限量的建立》中关于可沥滤物可耐受摄入量值（TI）以及的NOEL值推算BTHC静脉途径的TI值为：
TI=50 mg·kgbw-1·day-1÷（10×10×1）=0.5 mg·kg bw-1·day-1
其中，UF1=10，代表不同人体间个体差异系数；
UF2=10，代表动物与人之间物种差异系数；
UF3=1，代表试验数据的定性和相关性。
根据国标GB/T 16886.17—2005，成人平均体重按70 kg计算，每日BTHC的可耐受量（TE）为：
TE=UTF ×Mb× TI =1×0.5 mg·kg bw-1·day-1×70 kg=35 mg·day-1
其中，UTF=1，代表医疗器械的利用系数；
Mb，代表成人平均体重；
临床上血小板输注适用于防止和治疗血小板减少和血小板功能失调引起的出血或出血倾向，通常根据不同的病情决定输注血小板量[17]。按1个病人1 d输注1个治疗剂量血小板，血小板保存有效期为5 d。本研究表明血小板贮存袋保存血小板5 d时，1个治疗剂量的血小板中增塑剂BTHC含量平均为28.10 mg，低于成人每日可允许BTHC最大摄入量35 mg，故该产品在临床使用中是安全的。继续将血小板保存至7 d，结果显示1个治疗剂量的血小板中增塑剂BTHC含量为36.63 mg，高于成人每日可允许BTHC最大摄入量35 mg。
3.3 小结综上所述，本研究考察增塑剂BTHC在混合浓缩血小板中的溶出量并建立了准确可靠的检测方法，所得标准曲线线性关系良好，具有良好的灵敏度、精密度和准确度，能有效地测定BTHC在浓缩血小板中的溶出量，不但为评估该产品在临床使用中的溶出风险提供依据，更为今后以BTHC作为增塑剂的新型医疗器械和食品/药品新型包装材料的开发研究提供实验参考。
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