注射用厄他培南（ertapenem for injection）是美国默克公司研制生产的新型碳青霉烯类抗生素^[1]，化学名为（1R，5S，6S，8R，2S^*，4S^*）-2-[2-[3-羧基-苯基氨基甲酰基]-吡咯烷基-4-硫代]-6-（1-羟乙基）-1-甲基碳青霉烯-3-甲酸单钠盐^[2]。体外试验中，厄他培南对常见的革兰阳性、阴性需氧菌及厌氧菌均表现出极好的抗菌活性^[3]。厄他培南有着碳青霉烯类对治疗多重耐药菌感染可靠而且高效的优点，且不易产生耐药性，每日1次，使用方便^[4]。已获准用于治疗成人复杂性腹腔感染、社区获得性肺炎、复杂性皮肤和皮肤软组织感染、复杂性尿路感染和妇科感染等^[5-10]。

国外有研究从不同类型的生物基质中提取厄他培南，如血浆、尿液、支气管肺泡灌洗等组织，并通过一种窄孔柱测定厄他培南血药浓度的高效液相色谱/紫外法^[11]。另有用HPLC-UV和LC-MS法测定厄他培南的血药浓度^[12]。以上方法均需要很多固相萃取或液-液萃取，需要蒸发和重建，操作复杂，回收率低。目前，国内关于该药在生物基质中含量测定的方法学未见报道。本研究建立了HPLC法测定大鼠尾静脉注射后厄他培南的血药浓度，并考察其药动学。

1 仪器与试药

高效液相色谱系统，包括2695型泵、2489型紫外检测器和Empower Application操作平台（美国Waters公司）。

厄他培南对照品（含量97.0%，批号181512009）由石家庄中诺药业有限公司提供，甲硝唑（内标）对照品（含量99.6%，批号20140112）购自湖北宏源药业有限公司；乙腈为色谱纯，其他试剂均为分析纯，水为蒸馏水。

健康雄性SD大鼠，清洁级，体重（220±20）g，由河北医科大学实验动物中心（合格证：SCXK（冀）2013-1-003）提供，动物合格证编号：1607150。

2 方法与结果 2.1 血药浓度测定方法 2.1.1 溶液配制

厄他培南对照品储备液：精密称取厄他培南对照品40 mg，置10 mL量瓶中，用甲醇水（1:1）定容，配制成浓度为4 000 μg·mL^-1的厄他培南储备溶液，4 ℃保存待用。

内标溶液：精密称取甲硝唑对照品16 mg，置50 mL量瓶中，用甲醇水（1:1）定容，再取5 mL于10 mL量瓶定容，配制成浓度为160 μg·mL^-1的内标储备液，4 ℃保存待用。

2.1.2 色谱条件

色谱柱Diamonsil C₁₈柱（十八烷基硅烷键合硅胶，4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流动相乙腈：10 mmol·L^-1醋酸钠溶液（11.4:88.6）；流速1.0 mL·min^-1；检测波长295 nm；柱温35 ℃；进样量10 μL。

2.1.3 血样处理

取冷冻血样室温自然解冻，4 000 r·min^-1离心5 min，取上清液100 μL置带塞离心管中，加入内标溶液10 μL，涡旋混合30 s，加甲醇400 μL，涡旋混合1 min，10 000 r·min^-1离心5 min，取上清液进样分析。

2.1.4 专属性试验

取厄他培南对照品溶液和内标溶液直接进样；另取空白血浆和给药后大鼠血浆，分别按“2.1.3”项下方法处理并测定，记录色谱图。结果显示，在该色谱条件下，厄他培南、内标峰形良好，分离完全，且大鼠血浆中内源性物质不干扰测定。色谱图见图 1。

2.1.5 线性试验

取厄他培南储备液适量，用水稀释，分别制备浓度为2 000、1 000、500、200、100、50和20 μg·mL^-1的厄他培南对照品溶液。精密吸取10 μL，各置1.5 mL塑料带塞离心管中，氮气吹干，分别加入空白血浆100 μL，制得浓度为2~200 μg·mL^-1的模拟标准血浆。分别按“2.1.3”项下方法处理并进样测定。以厄他培南、内标峰面积之比R为纵坐标，血药浓度C为横坐标，进行线性回归，得回归方程：

$ R = 0.014\;8{\rm{C}}-0.020\;9\;\;\;\;\;\;r = 0.9998 $

厄他培南在2~200 μg·mL^-1范围内线性关系良好，最低定量限（LLOQ）为2 μg·mL^-1。

2.1.6 回收率试验

取空白血浆，按“2.1.5”项下方法分别制备低、中、高浓度（2、50和160 μg·mL^-1）厄他培南模拟标准血浆，各5份。均按“2.1.3”项下方法处理并进样测定，记录峰面积。取空白血浆，制备内标模拟标准血浆，共5份。以模拟标准血浆中厄他培南、内标的峰面积与等量厄他培南、内标对照品溶液直接进样的峰面积之比计算绝对回收率。根据标准曲线计算药物浓度，以测得药物浓度与已知药物浓度之比计算方法回收率。结果厄他培南的绝对回收率（n=5）分别为（98.3±6.4）%、（96.4±1.7）%和（99.3±1.2）%，方法回收率分别为（107.9±2.5）%、（87.6±3.1）%和（99.6±2.2）%。内标的绝对回收率为（98.1±1.9）%。

2.1.7 精密度试验

同上分别制备低、中、高浓度的厄他培南模拟标准血浆，各5份，分别室温放置1、2、3 h后按“2.1.3”项下方法处理并进样测定；另按“2.1.3”项下方法连续3 d处理并进样测定，结果计算得日内RSD分别为2.3%、3.5%和2.2%，日间RSD分别为1.0%、1.2%和2.6%。

2.1.8 稳定性试验

按“2.1.5”项下方法制备厄他培南模拟标准血浆（50 μg·mL^-1），在常温放置3 h、-40 ℃保存7 d及反复冻融3次，然后按“2.1.3”项下方法处理，进样测定，结果RSD分别为4.6%、4.8%和3.6%，表明厄他培南在上述条件下稳定性良好。

2.1.9 稀释效应

取20 μL的4 000 μg·mL^-1厄他培南对照品溶液，各5份，吹干后用500 μL空白血浆复溶制备厄他培南模拟标准血浆（160 μg·mL^-1），混匀后按“2.1.3”项下方法处理，进样测定，结果RSD为0.4%，表明厄他培南在上述条件下稳定性良好。

2.2 药动学试验 2.2.1 溶液的配制

精密称取厄他培南对照品400 mg，置10 mL量瓶中，用生理盐水溶解并定容，配成40 000 μg·mL^-1的厄他培南溶液，4 ℃保存待用。

2.2.2 给药方案

5只大鼠给药前禁食12 h，自由饮水，给药前对大鼠编号并称重，按厄他培南100 mg·kg^-1对5只大鼠分别进行尾静脉注射给药。于给药前及给药后2、5、10、20、30、45 min和1、2和3 h于眼眦取血约0.4 mL（取血过程中给实验动物补充体液），置含有肝素的抗凝带塞塑料离心管中，10 000 r·min^-1离心5 min，取上层血浆，-40 ℃冰箱保存待测。

2.2.3 血样测定和数据处理

取待测血样室温放置自然解冻，按“2.1.3”项下方法处理并进样测定。用标准曲线计算血药浓度，采用DAS2.0软件进行自动拟合处理。大鼠体内厄他培南的药-时曲线见图 2，药动学参数见表 1。

3 讨论

本实验建立了一种快速、灵敏的HPLC方法用于测定大鼠体内的厄他培南。在预实验时分别考察了流动相的组成、配比、pH^[13-15]；选择血样处理方法时，用正丁醇、异丙醇、甲醇、乙腈等分别对血样进行蛋白沉淀，结果甲醇的效果最好，提取回收率高，并排除内源性干扰。