2017, Vol. 37 
2. 中国医学科学院 北京协和医院 免疫科, 北京 100032
2. Immunology Department, Peking Union Medical College Hospital, Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100032, China
系统性红斑狼疮（systemic lupus erythematosus，SLE）是一种弥漫性、全身性自身免疫病，主要累及皮肤粘膜、骨骼肌肉、肾脏及中枢神经系统，同时还可以累及肺、心脏、血液等多个器官和系统，表现出多种临床表现。神经系统和泌尿系统受累常见，按照主要受累器官或组织的不同，可进一步分类为狼疮肾炎、神经精神性狼疮、狼疮肺炎、狼疮心肌炎和狼疮肝炎等。系统性红斑狼疮的病因及发病机理不清，并非单一因素引起，可能与遗传、环境、性激素及免疫等多种因素有关[1-5]。
神经精神性狼疮（neuro psychiatric lupus erythematosus，NPLE）指SLE神经系统损害相关的神经精神表现，是SLE急性期或终末期出现的严重并发症，为预后不良的表现，14%~75%的狼疮病人可出现神经精神症状。它是SLE的严重并发症，属于危象的特征之一，可以发生于SLE的任何时期。目前国内NPSLE急性期主要采用大剂量甲泼尼龙（methylprednisolone，MP）或加用环磷酰胺（cyclophnosphamide，CP）静脉冲击，联合鞘内注射甲胺喋呤（methotrexate，MTX）和地塞米松的治疗方案[6-8]。
与正常人相比，NPSLE患者的血脑屏障易受破坏或发生通透性改变，药物穿透血脑屏障进入脑脊液的程度可能有所改变。但是，目前对于NPSLE患者激素和免疫抑制剂穿透血脑屏障的研究相对较少，现行的治疗方案在脑脊液局部是否可以有效尚缺乏可靠证据支持[9]。本研究通过建立人血浆与脑脊液中同时测定MP、CP和MTX的高效液相-串联质谱法，并通过前瞻性研究方法，初步评价了3种药物在NPSLE患者中的血脑屏障穿透率，为进一步进行NPSLE患者中激素和免疫抑制剂穿透血脑屏障的研究提供支持。
1 材料 1.1 仪器ACQUITY UPLC超高效液相色谱系统（美国Waters公司）；API-5500三重四极杆串联质谱系统（美国Sciex公司）；ACQUITY UPLC CSH色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm；Waters公司）；METTLER TOLEDO电子分析天平；Waters Milli-Q超纯水系统等。
1.2 药品与试剂对照品甲泼尼龙琥珀酸钠（纯度100%，批号：100827-200501），环磷酰胺（CP，纯度93.4%，批号：100234-200502），甲胺喋呤（MTX，纯度99.4%，批号：100138-201104）购自中国食品药品检定研究院，4-氨基苯乙酮（纯度99.0%，Sigma公司，批号：STBB5047V）。乙腈为色谱纯，甲酸为分析纯。
空白血浆和空白脑脊液均来自于北京协和医院。
2 方法 2.1 储备液的配制精密称取甲泼尼龙琥珀酸钠对照品12.67 mg，乙腈定容至10 mL，作为MP 1 mg·mL-1储备液；精密称取CP对照品11.43 mg，乙腈定容至10 mL，作为CP 1 mg·mL-1储备液；精密称取MTX对照品5.01 mg，乙腈定容至5 mL，作为MTX 1 mg·mL-1储备液；精密称取4-氨基苯乙酮对照品10.1 mg，乙腈定容至10 mL，作为4-氨基苯乙酮1 mg·mL-1储备液。
2.2 标准曲线和质控样品的配制以人空白血浆为基质，配制标准曲线以及质控。血浆中3种药物标准曲线浓度范围分别为MP 0.5~500 ng·mL-1（0.5、1.0、2.0、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1），CP 0.5~200 ng·mL-1（0.5、1.0、2.0、10、20、50、100、200 ng·mL-1），MTX 0.5~500 ng·mL-1（0.5、1.0、2.0、10、20、50、100、200、500 ng·mL-1）。质控样品的浓度分别为MP 1.5、30、150和300 ng·mL-1、CP 1.5、30和150 ng·mL-1，MTX 1.5、30、150和300 ng·mL-1。
以乙腈-水（1:1）为溶剂配制20倍浓度的标线质控工作液，吸取5 μL工作液加入到95 μL空白脑脊液中分别配制成标线质控。脑脊液中3种药物标准曲线浓度范围均为0.5~200 ng·mL-1（0.5、1.0、2.0、10、20、50、100、200 ng·mL-1），质控样品浓度均为1.5、15和150 ng·mL-1。
2.3 样品处理方法 2.3.1 血浆样品[10-12]在避光条件下，将血浆样品在室温下融化并充分混匀。吸取100 μL血浆样品，加入内标工作液50 μL和乙腈250 μL，振荡1 min后13 000 r·min-1离心10 min，取上清液350 μL置于玻璃管中，40 ℃ N2下吹干，加入乙腈-水（20:80）溶液200 μL复溶后，进样10 μL。
2.3.2 脑脊液样品在避光条件下，将脑脊液样品在室温下融化并充分混匀。使用5 μL脑脊液的标线质控工作液加入到95 μL空白脑脊液中分别配制成标线质控。吸取脑脊液样品100 μL，分别加入内标工作液30 μL和乙腈70 μL，振荡1 min后，加入去离子水100 μL，在室温条件下13 000 r·min-1离心10 min，取上清液200 μL置于进样管中，进样10 μL。
2.4 UPLC-MS/MS条件 2.4.1 色谱Waters ACQUITY UPLC CSH色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm），流动相A相为含0.1%甲酸的水溶液，B相为含0.1%甲酸的乙腈溶液。梯度洗脱（0~0.6 min，95%A；0.6~1.7 min，95%A→10%A；1.7~2.0 min，10%A→95%A；2.0~2.5 min，95%A）；流速：0.4 mL·min-1；柱温：30 ℃；自动进样器温度：10 ℃；进样量：10 μL。
2.4.2 质谱三重四极杆串联质谱仪，电喷雾离子源（ESI），Sciex公司Analyst v1.5.1工作站。离子源温度500 ℃，CAD为7，喷口电压为5 500 V，雾化气Gas1为50，Gas2为50。采用正离子和负离子扫描，多反应监测（MRM）的质谱扫描方式进行测定。MP为负离子扫描，MRM离子对为m/z 373.1→343.2；CP为正离子扫描，MRM离子对为m/z 261.0→233；MTX为正离子扫描，MRM离子对为m/z 455.0→308；内标4-氨基苯乙酮为正离子扫描，MRM离子对为m/z 136.0→93.8。
2.5 分析方法的验证[12-15] 2.5.1 方法的特异性分别取6名受试者的空白血浆100 μL或空白脑脊液100 μL，除不加内标外，其余按“2.3”项处理，进样10 μL，得色谱图 1-A和图 1-B。谱图表明：方法的特异性良好，人血浆和脑脊液中不存在影响化合物测定的内源性干扰。
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图 1 空白血浆（A）和空白脑脊液（B）典型MRM色谱图 Figure 1 Typical MRM chromatograms of blank plasma(A)and blank CSF(B) |
用空白人血浆及空白人脑脊液配制标准曲线。血浆MP和MTX标准曲线浓度为0.5、1.0、.0、10、20、50、100、200和500 ng·mL-1；血浆CP标准曲线浓度为0.5，1.0、2.0、10、2、100和200 ng·mL-1；脑脊液MP、CP和MTX标准曲线浓度均为0.5、1.0、2.0、10、20、50、100和200 ng·mL-1。按“2·3”项样品处理分别依法操作。以血浆中待测物浓度（X，ng·mL-1）为横坐标，待测物与内标物的峰面积比值（Y）为纵坐标，进行线性回归。化合物在标准曲线浓度范围内，其浓度与响应值之间具有良好的相关性，全部标准曲线的相关系数（r）均在0.990~1.000之间，3个化合物在人血浆和脑脊液中LLOQ的典型谱图如图 2-A和图 2-B所示。
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图 2 人血浆（A）和脑脊液（B）中LLOQ的典型谱图 Figure 2 Typical LLOQ chromatograms of human plasma(A)and CSF(B) |
用空白血浆配制低、中、高浓度（1.5、30、150和300 ng·mL-1）的质控样品，每个浓度水平进行6个样本的分析；用空白脑脊液配制低、中、高浓度（1.5、15、150 ng·mL-1）的质控样品，每个浓度水平进行5个样本的分析。连续测定3 d。根据当日随行标准曲线计算质控样品的浓度，求得方法的日内、日间精密度（RSD）和准确度。结果见表 1，数据表明3个化合物的准确度和精密度均良好。
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表 1 生物基质中质控样品批内及批间精密度、准确度 Table 1 Intra-day and inter-day precision and accuracy of matrix quality control samples |
取空白血浆，按“2.3.1”项下方法操作N2吹干后，使用与质控浓度相等的混合对照品溶液复溶；另配制与质控浓度相等的混合对照品溶液。进样，每个浓度水平进行6个样本的分析，获得相应峰面积。以每一浓度的2种处理方法的峰面积比值计算基质效应。结果见表 2，数据表明3个化合物的基质效应能满足测定的要求。
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表 2 血浆回收率和基质效应 Table 2 Matrix effect and extraction recovery in plasma |
按“2.3.1”项下方法分别配制低、中、高浓度的质控样品并进行测定；另取空白血浆，按“2.3.1”项下方法操作N2吹干后，使用与质控浓度相等的混合对照品溶液复溶。进样，每个浓度水平进行6个样本的分析，获得相应峰面积，以每一浓度的2种处理方法的峰面积比值计算萃取回收率。结果见表 2，数据表明3个化合物的萃取回收率能满足测定的要求。
2.5.6 稳定性 2.5.6.1 自动进样器稳定性取低、中、高浓度的血浆质控样本和脑脊液质控样本各5份，进行样品前处理后在自动进样器中（10 ℃）放置12 h后进样测定。结果精密度（RSD）均 < 15%，相对误差在均±15%范围内，表明样本经处理后，在自动进样器中可以稳定保存24 h。结果见表 3。
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表 3 血浆和脑脊液的稳定性评价 Table 3 Stability assessments in plasma and CSF |
取低、中、高浓度的脑脊液质控样本各5份，在室温放置12小时后进行样品前处理并进样测定。结果精密度（RSD）均 < 15%，相对误差在均±15%范围内，表明脑脊液样本在室温可稳定放置12 h。结果见表 3。
2.5.6.3 稀释可靠性使用空白血浆将浓度为2 000 ng·mL-1的血浆样本稀释20倍，使用空白脑脊液将浓度为2000 ng·mL-1的脑脊液样本稀释20倍后进行样品前处理并进样测定。结果精密度（RSD%）均 < 15%，相对误差在均±15%范围内，表明血浆和脑脊液样本稀释20倍后能够准确测定。
2.6 方法的应用本方法用于检测35例使用MP，28例使用CP和11例使用MTX治疗的NPSLE患者的3个化合物血浆浓度达峰时，血浆样本与相应时间的脑脊液样本，可快速准确地提供可靠的分析结果，用于评价3种药物的血脑屏障穿透率。具体给药方案如下[9]：
甲泼尼龙琥珀酸钠组：注射用甲泼尼龙琥珀酸钠粉末，比利时辉瑞医药公司生产。甲泼尼龙琥珀酸钠粉末溶于5%葡萄糖溶液100 mL或250 mL中，每位受试者一次静脉滴注40或500或1 000 mg甲泼尼龙琥珀酸钠，滴注速度为40~60滴·min-1，输注时间至少为30 min。
CP组：注射用CP粉末（0.2 g·瓶-1），中国江苏恒瑞医药股份有限公司生产。每位受试者1次静脉滴注0.4或0.8 g CP。给药前1周内未使用过CP。CP粉末溶解于0.9%氯化钠溶液100 mL中，滴注速度为40~60滴·min-1，输注时间至少滴注30 min。
MTX组：MTX片剂（2.5 mg·片-1），中国上海信谊制药厂生产。每位受试者1次口服10 mg或15 mg MTX，服药前1周内未使用过MTX。
3 结果与讨论 3.1 3种药物血脑屏障穿透率的初步评价经统计分析，在血药浓度达峰时间，CP的血脑屏障穿透率在11.3%~40.4%；而MP的穿透率较低，大约在0.11%~3.72%；而除1位受试者由于血脑屏障受损，MTX血脑屏障穿透率为28.82%，其余受试者结果显示MTX几乎不能穿透血脑屏障。证明临床鞘内注射MTX是较为合理的用药方式，CP穿透能力相对较高，静脉用药也可在中枢神经系统局部发挥药效。
3.2 讨论本研究建立了测定人血浆和脑脊液中3种抗神经精神狼疮药物的UPLC-MS/MS检测方法。其中MTX和CP为正离子扫描模式，而MP为负离子扫描模式。基于3种化合物的保留时间分别为MTX 1.32 min，CP 1.63 min，MP 1.83 min，并且3种化合物达到基线分离，故在1.70 min处将正离子扫描模式切换为负离子扫描模式，实现1次进样同时检测MTX、CP和MP3个目标化合物。
由于健康人空白脑脊液来源极其有限，在脑脊液测定过程中，对标准曲线和质控不采用一次性大量配制分装，而是在制备过程中单独稀释配制，其余制备过程与生物样本保持一致。该处理方法在空白脑脊液稀缺的前提下尽可能地保证了标线质控的基质与生物样本一致。实验结果证明，该制备方法能够最大限度地节省空白脑脊液并真实反应生物样品的浓度。
该方法灵敏度高、特异性强，且各项验证结果均符合生物样品定量分析指导原则[5]的要求，因此能够快速地测定血浆和脑脊液样本，提供准确可靠的分析结果。
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