2017, Vol. 37 
α-羟基酸是指在α位有羟基的羧酸，是一组弱的吸湿性有机酸，包括酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙醇酸等，最初是从苹果、柠檬、甘蔗等水果和植物中提取的，也称果酸[1]。α-羟基酸是一类小分子的物质，可通过渗透至皮肤角质层，使老化角质层中的细胞间键合力减弱，加快细胞更新速度，促进死亡细胞脱离，从而使皮肤表面光滑、细嫩、柔软，因此具有除皱、抗衰老的作用，在化妆品生产中已得到广泛的应用[2]。杨艳伟[3]等通过研究统计分析化妆品中α-羟基酸的使用种类、频率和用量，研究表明化妆品中一般会适当添加一种或者2种以上的α-羟基酸原料，其中使用频率较高的是乙醇酸和乳酸。
但是人们在应用中发现，无论单独使用或混合使用α-羟基酸均有一定的副作用，过量使用会导致皮肤产生红斑、漂白、肤色改变、水肿等较强的刺激性、光敏性[4]。我国《化妆品卫生规范规》[5]规定化妆品配方中α-羟基酸的使用总量不得超过6%，同时使用状态下产品的pH不得小于3.5，故需建立一种高效、灵敏、准确的方法来对化妆品中α-羟基酸的量进行检测。目前化妆品中α-羟基酸的检测方法主要有高效液相色谱法[6]、离子色谱法[7]、气相色谱法[8]、毛细管电泳[9-11]。本文采用HPLC-MS/MS[12-14]法对化妆品中酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸、乙醇酸等5种α-羟基酸进行含量测定方法研究，为含有α-羟基酸的化妆品质量检测提供了一种有效的分析方法。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 6410B高效液相色谱三重四极杆质谱联用仪（美国安捷伦科技有限公司）；Milli-Q超纯水系统（美国Millipore公司）；METTLER XS105DE电子天平（瑞士METTLER公司），和达超声波（厦门和伟达超声波设备有限公司）；Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（十八烷基硅烷键合硅胶柱；4.6 mm×75 mm，3.5 μm，美国安捷伦科技有限公司）。
1.2 试药对照品：酒石酸（批号20618，含量以99.8%计）、乙醇酸（批号30710，含量以99.9%计）、乳酸（批号30104，含量以91.2%计）均购自Dr. Ehrenstorfer GmbH；苹果酸（批号190013-201001，含量以100.0%计）、柠檬酸（批号111679-200401，含量以100.0%计）均购自中国食品药品检定研究院。甲醇（色谱纯，Merck，Germany），甲酸（分析纯，国药集团化学试剂有限公司），水为超纯水。样品：S1（去角质保湿足膜，批号I23001）、S2（草本去角质乳液，批号F611A1）、S3（紧致修护面霜批号F610A1）、S4（角质修护焕肤液批号CH03700615）均来自厦门市食品药品质量检验研究院留样。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用Agilent ZORBAX SB-C18（4.6 mm×75 mm，3.5 μm）色谱柱，柱温25 ℃；流动相：0.1%甲酸水溶液-甲醇（98:2），流速0.4 mL·min-1；进样量5 μL。
2.2 质谱条件电喷雾（ESI±）离子源，干燥气温度325 ℃；干燥气流速11 L·min-1；喷雾压力0.24 MPa；毛细管电压：正离子4.0 kV，负离子3.5 kV；Delta EMV（±）：200 V。各成分的质谱参数见表 1。
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表 1 5种成分的质谱参数 Table 1 The MS/MS parameters of 5 components |
分别精密称取5种α-羟基酸对照品适量，加水超声溶解，配制成10 mg·mL-1的各对照品储备液，在4 ℃下保存。临用时将储备液用超纯水稀释成每1 mL约含1.0 mg乙醇酸、0.1 mg酒石酸、0.5 mg乳酸、0.02 mg苹果酸、0.01 mg柠檬酸的混合对照品溶液。提取的定量离子色谱图见图 1。
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图 1 对照品溶液中5种成分定量离子二级质谱图 Figure 1 The MS/MS chromatograms of 5 components in standard solution |
精密称取供试品0.5 g置于10 mL量瓶中，水浴去除挥发性有机溶剂，加水适量，超声20 min提取，放冷至室温，用水稀释并定容至刻度，摇匀。取适量的样品在5 000 r·min-1下高速离心15 min，取上清液经0.22 μm滤膜过滤，即得。当供试品溶液中α-羟基酸浓度过高时，精密吸取上清液1.0 mL，置于25 mL量瓶，用水稀释并定容至刻度，摇匀，0.22 μm滤膜过滤，即得。
2.5 线性关系、检出限与定量限精密吸取混合对照品溶液适量，置10 mL量瓶中，加水稀释得系列浓度的混合对照品溶液；精密吸取系列浓度的混合对照品溶液各5 μL，进样测定，以浓度（μg·mL-1）为横坐标，峰面积为纵坐标，进行线性回归。以S/N为3计算各成分的检出限，以S/N为10计算各成分的定量限，结果见表 2，表明各成分在各自线性范围内线性关系良好。
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表 2 标准曲线测定、检出限与定量限检测结果 Table 2 The results of linear regression, LODs and LOQs of the investigated compounds |
取混合对照品溶液，连续进样6次，各成分色谱峰峰面积的RSD分别为1.5%、1.6%、0.8%、0.5%、2.5%，表明精密度良好。
2.7 稳定性试验取加样回收率供试品溶液，室温放置，于0、4、8、12、24 h分别进样测定。结果各成分峰面积的RSD分别为2.0%、1.3%、0.9%、0.5%、2.6%，表明供试品溶液在24 h内基本稳定。
2.8 重复性试验取样品S1，取0.4、0.5、0.6 g各3份，精密称定，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，进样测定；结果乳酸和乙醇酸的含量分别为1.51%和3.31%，RSD分别为1.5%和3.2%，表明方法重复性良好。
2.9 加样回收率试验取样品S1 9份，每份约0.2 g，精密称定，分别加入3种浓度水平的混合对照品溶液适量，按“2.4”项下方法制备供试品溶液，进样测定，计算回收率，结果见表 3，表面本方法回收率较好。
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表 3 加样回收率试验结果 Table 3 The result of recovery |
取各样品，依法测定，结果见表 4。
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表 4 样品测定结果（%，n=3） Table 4 Determination of 5 components |
根据《化妆品卫生规范》2007年版，由于5种α-羟基酸均没有生色团，采用紫外检测器时只能在末端吸收处进行测定，且化妆品基质复杂，含有的α-羟基酸较少，采用紫外检测器干扰多，无法准确测定，因此选择了质谱检测器，以MRM方式进行测定，可以避免其他成分的干扰，专属性强，重现性较好，可准确测定化妆品中的α-羟基酸含量。
3.2 质谱条件的选择α-羟基酸在正负离子模式下均有较好响应。经试验发现，在负离子模式下酒石酸、苹果酸、乳酸、柠檬酸具有更好的响应值和峰形，而乙醇酸的响应值较低，且乙醇酸和酒石酸的保留时间相当，因此乙醇酸采用正离子模式，提高响应值。
3.3 样品分析α-羟基酸在各企业产品中含量差异较大，有的样品中含量很低，而且化妆品成分复杂，干扰大，因此有必要建立一种高效灵敏的检测方法对化妆品中的α-羟基酸含量进行监控，以保证化妆品的安全性。
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