2017, Vol. 37 
盐酸雷尼替丁（ranitidine hydrochloride）为组胺H2受体阻断剂，能抑制基础胃酸分泌及刺激后的胃酸分泌，还可抑制胃蛋白酶的分泌。用于治疗致病性胃肠道高分泌状况，如卓-艾综合征，良性活动性胃溃疡，短期治疗活动性十二指肠溃疡，胃食管反流的短时间缓解等。目前对于盐酸雷尼替丁的含量测定方法主要有液相色谱法[1-4]、紫外-可见分光光度法[5-6]、荧光分光光度法[7-8]、电化学方法[9]、电位滴定法[10]、薄层色谱法[11-12]、毛细管电泳法[13-14]、液相色谱-质谱联用法[15-16]等。应用盐酸雷尼替丁注射液含量测定的法定方法主要为液相色谱法[17-19]，有关物质的法定测定方法为液相色谱法[17-18]和薄层色谱法[19]，但液相色谱法中使用的高盐流动相对液相设备的稳定性影响较大，薄层色谱法在有关物质的分析上不能精确定量。有研究采用毛细管电泳方法对盐酸雷尼替丁的含量和有关物质同时测定[20-21]，但限于方法检出限要高于液相色谱，检测溶液配制的浓度较高，依据毛细管电泳的分离的电渗流原理，并不利于兼顾高浓度的雷尼替丁和低浓度的杂质的同时检测，而且分析的时间与液相色谱相比较也并无优势。本文利用高灵敏度的毛细管色谱柱，建立适合质量标准的区带毛细管电泳法同时测定盐酸雷尼替丁注射液的含量及有关物质，为盐酸雷尼替丁注射液的质量控制进行了探索性的研究。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 7100毛细管电泳仪（二极管阵列检测器），使用Agilent Chemstation软件工作站；毛细管为扩展光程（鼓泡检测池）未涂渍熔融石英毛细管（有效长度：56 cm；内径：75 μm；鼓包因子：2.7）（安捷伦公司）；SenvenMulti pH计（METTLER TOLEDO公司）；
1.2 试剂和药品对照品盐酸雷尼替丁（批号：H1G103）、雷尼替丁杂质A（5-{[（2-aminoethyl）-thio]methyl}-N，N-dimethyl-2-furanmethanamine，hemifumarate salt；批号：I0L576）、雷尼替丁杂质B（N，N’-bis{2-[（{5-[（dimethylamino）methyl]-2-furanyl}methyl）thio]ethyl}-2-nitro-1，1-ethenediamine；批号：G1D347）和雷尼替丁杂质C（N-{2-[（{5-[（dimethylamino）methyl]-2-furanyl}methyl）sulfinyl]ethyl}-N’-methyl-2-nitro-1，1-ethenediamine；批号：R04740）源自USP；盐酸雷尼替丁注射剂（规格为2mL：50mg（以C13H 22N4O3S计）源自上海现代哈森（商丘）药业有限公司（批号1412070121，亚批号3-14、批号1509210121，亚批号4-21、批号1509230121，亚批号3-13）和杭州民生药业有限公司（批号1506166、1504073、1503134）；超纯水为Milli-Q纯水机制得；氢氧化钠、柠檬酸三钠和柠檬酸为分析纯，甲醇为色谱纯。
2 实验方法 2.1 溶液的配制 2.1.1 运行缓冲液取30 mmol·L-1的柠檬酸三钠溶液，用30 mmol·L-1的柠檬酸溶液调节pH至5.5，临用前经0.45 mm超滤膜过滤，超声（功率100 W，频率40 kHz）脱气处理。
2.1.2 对照品储备液精密称取盐酸雷尼替丁对照品56.17 mg，置50 mL量瓶中，用运行缓冲液适量溶解并稀释至刻度，作为雷尼替丁储备液。精密称取雷尼替丁有关物质A、B、C对照品10.03 mg、10.03 mg、10.05 mg，分别置10 mL量瓶中，各加甲醇2 mL使溶解，用运行缓冲液稀释至刻度，作为有关物质储备液。
2.1.3 有关物质供试品溶液精密量取盐酸雷尼替丁注射液2 mL，置50 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀备用。
2.1.4 有关物质对照溶液精密量取有关物质供试品溶液1 mL，置100 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀备用。
2.1.5 含量测定供试品溶液精密量取有关物质供试品溶液5 mL，置50 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀备用。
2.1.6 系统适应性溶液①精密称取雷尼替丁对照品10.51 mg，置10 mL量瓶中，精密加入有关物质A、B、C储备液各0.1 mL，用运行缓冲液稀释到刻度，摇匀。
2.1.7 系统适应性溶液②精密称取雷尼替丁对照品11.74 mg，置10 mL量瓶中，加1 mol·L-1氢氧化钠溶液1.0 mL，加水约6 mL，振摇使溶解，摇匀，室温放置1 h后，加1 mol·L-1盐酸溶液1.0 mL，加水稀释至刻度，摇匀。
2.2 电泳条件采用正极压力进样方式，进样压力为3.0 kPa，进样时间为10 s，检测波长为230 nm，柱温为25 ℃。每5~6针运行样品之间依次用0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液冲洗3 min、超纯水冲洗2 min、运行缓冲液冲洗5 min。每天实验前毛细管依次采用甲醇、超纯水、0.1 mol·L-1盐酸溶液、超纯水、0.1 mol·L-1氢氧化钠溶液、水、运行缓冲液各冲洗5 min，以便获得更好的重复性。
3 实验结果 3.1 电泳条件的优化 3.1.1 测定波长根据二极管阵列检测器（DAD）上扫描获得的图谱，雷尼替丁与有关物质A、B、C，以及碱降解物（中国药典2015年版杂质Ⅰ）均在230 nm处有最大吸收，并且根据BP2016版[18]和中国药典2015年版[17]盐酸雷尼替丁注射液含量以及有关物质标准的波长均为230 nm，因此本实验选择230 nm波长作为含量测定以及有关物质的检测波长。
3.1.2 运行缓冲液pH和缓冲盐类型分别考察了磷酸-磷酸二氢钠缓冲液（pH2.5）、柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液（pH4.0、pH5.0、pH5.5、pH6.0）、硼砂-硼酸缓冲液（pH8.0、pH9.0、pH10.0）。系统适用性溶液各成分峰在柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液体系中峰型和分离度最佳，并且全部基线分离，其中以缓冲体系pH为5.5时雷尼替丁和有关物质C的分离度为最大。因此选择柠檬酸三钠-柠檬酸缓冲液（pH5.5）作为运行缓冲液。
3.2 运行缓冲液浓度分别考察了10、20、30、40 mmol·L-1浓度下的运行缓冲液。雷尼替丁与有关物质C均实现基线分离，并且随着浓度增加雷尼替丁保留时间延长，雷尼替丁与有关物质C的分离度增加，但在40 mmol·L-1浓度条件下系统的焦耳热超过上限。因此选择30 mmol·L-1浓度的运行缓冲液。
3.3 毛细管电泳进样条件的选择分别考察了1.0 kPa、2.0 kPa、3.0 kPa进样压力以及5 s、10 s、15 s进样时间，雷尼替丁和有关物质C均能实现基线分离，考虑到有关物质需要对低含量的杂质有足够的检测灵敏度，同时又不能使高含量的雷尼替丁峰产生明显的拖尾。因此选择3.0 kPa进样压力以及10 s的进样时间。
分别考察了20 ℃、25 ℃、30 ℃的柱温，除了出峰时间有变化外色谱行为基本没有变化。因此选择25 ℃的柱温。
3.4 样品溶剂的选择考虑到样品为水溶液，考察了以水作为溶剂配制对照品以及样品溶液，经与用运行缓冲液作为溶剂比较，色谱图峰型更加尖锐，检出限更低，但稳定性较差。因此选择运行缓冲液作为溶剂。
3.5 含量测定方法学验证 3.5.1 线性范围及限度试验精密量取盐酸雷尼替丁对照品储备液2.5、5.0、7.5、10.0 mL，分别置50 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀，分别作为标曲溶液④⑤⑥⑦，再精密量取标曲溶液④1.0，1.0，2.0 mL，分别置50，10，10 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀，分别作为标曲溶液①②③，0.45 μm滤膜过滤后测定。以雷尼替丁对照品的峰面积（Y）对溶液浓度（X，μg·mL-1）进行线性回归，得回归方程（n=7）：
Y=4.329 X-1.550 r=0.999 9
表明雷尼替丁在1.015~203.1 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好。取标准曲线溶液，用运行缓冲液依次稀释成浓度递减的溶液，测得雷尼替丁的定量限和检出限分别为1.015 μg·mL-1（S/N=10）与0.338 μg·mL-1（S/N=3）。
3.5.2 专属性试验雷尼替丁与有关物质A、B、C及碱降解产物的分离：根据BP2016版[18]和USP36版[19]的雷尼替丁注射液含量测定系统适应性的要求，雷尼替丁峰与有关物质C峰相邻，分离度应达到要求。取系统适应性溶液①、②分别经0.45mm滤膜过滤，按照“2.2项”的电泳条件，记录电泳图谱。
结果表明：盐酸雷尼替丁与有关物质A、B、C之间均有较好的分离度，碱降解产物（中国药典2015年版中杂质Ⅰ）与雷尼替丁之间以及雷尼替丁与相邻杂质峰的分离度也符合要求，经二极管阵列检测器对各峰的纯度分析，均未发现有重叠峰现象。
3.5.3 重复性及日间精密度取盐酸雷尼替丁注射剂，按照“2.1.5项”配制6份供试品溶液，0.45 μm滤膜过滤后测定，雷尼替丁的含量为101.1%，RSD为1.6%。取同批号样品连续3d同法操作，雷尼替丁的含量为100.8%，RSD为1.0%。表明本法的重复性以及日间精密度良好。
3.5.4 稳定性取标准曲线溶液⑤，分别于0、2、4、6、8、12、24 h，按照“2.2项”的电泳条件进行测定，雷尼替丁峰面积的RSD为2.5%。表明本法的稳定性较好。
3.5.5 准确度精密量取盐酸雷尼替丁注射液2.0 mL，置50 mL量瓶中，再精密量取2.5 mL，置50 mL量瓶中（9份），分别精密加入雷尼替丁对照品储备液1.5 mL、2.5 mL、3.5 mL各3份，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤后测定。雷尼替丁的平均回收率为99.3%（RSD=3.3%；n=9）。表明本法的准确度较好。
3.5.6 含量测定取盐酸雷尼替丁注射液，按照“2.1.5项”配制供试品溶液，0.45 μm滤膜过滤后按照“2.2项”测定，图谱见图 1，雷尼替丁的含量结果见表 1。本法测定的雷尼替丁的含量与法定的HPLC法测定的结果基本一致。
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1.有关物质A（related compound A）2.有关物质B（related compound B）3.有关物质C（related compound C）4.碱降解产物（杂质Ⅰ[17]）related compound by alkali destroyed（related compound Ⅰ[17]） A.空白样品（blank solution）B.雷尼替丁对照（ranitidine standard solution）C.样品含量溶液（sample solution of content）D.系统适应性溶液①（system suitability solution①）E.系统适应性溶液②（system suitability solution②）F.有关物质样品溶液（sample solution of related substance） 图 1 含量及有关物质色谱图 Figure 1 The chromatograms of determination for content and related substances |
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表 1 盐酸雷尼替丁注射液含量测定结果 Table 1 Results of contents for ranitidine hydrochloride injection |
精密量取有关物质A、B、C对照品储备液各0.5、0.5、0.5、1.0、1.5、2.0 mL，分别置100、50、10、10、10、10 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀，分别作为有关物质标准曲线溶液③④⑤⑥⑦⑧，再精密量取有关物质标准曲线溶液⑤1.0、1.0 mL，分别置50、20 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀，分别作为有关物质标准曲线溶液①②，0.45 μm滤膜过滤后测定。分别以有关物质A、B、C对照品的峰面积（Y）对溶液浓度（X，μg·mL-1）进行线性回归，得回归方程（n=8）：
Y=3.552 X-0.4677 r=0.999 9
Y=3.672 X+2.314 r=0.999 8
Y =3.388 X+3.099 r=0.999 7
表明有关物质A、B、C分别在0.7893~157.9 μg·mL-1、1.003~200.6 μg·mL-1、1.005~201.0 μg·mL-1的浓度范围内线性关系良好，根据标曲的斜率计算得有关物质A、B、C的相对校正因子分别为1.2188、1.1788、1.2777，基本与雷尼替丁响应因子一致，可以采用自身对照法测定，不需要进行校正。
3.6.2 有关物质A、B、C的限度取有关物质标曲溶液，用运行缓冲液依次稀释成浓度递减的溶液，测得有关物质A、B、C的定量限和检出限分别为0.789 μg·mL-1、1.003 μg·mL-1、1.005 μg·mL-1（S/N=10）与0.395 μg·mL-1、0.502 μg·mL-1、0.502 μg·mL-1（S/N=3）。
3.6.3 重复性取盐酸雷尼替丁注射液，按照“2.1.3项”配制6份有关物质供试品溶液及对照溶液，0.45 μm滤膜过滤后按照“2.2项”测定，图谱见图 1，有关物质测定结果见表 2。表明本法有关物质测定的重复性较好。
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表 2 盐酸雷尼替丁注射液有关物质测定结果（n=6） Table 2 Results of related substances in ranitidine hydrochloride injection |
分别精密称取有关物质A、B、C对照品各约10 mg，置同一10 mL量瓶中，加甲醇5 mL使溶解，用运行缓冲液稀释至刻度，作为有关物质准确度储备液。精密量取盐酸雷尼替丁注射液2.0 mL，置50 mL量瓶中（9份），分别精密加入有关物质准确度储备液0.5 mL、0.75 mL、1.0 mL各3份，用运行缓冲液稀释至刻度，摇匀，0.45 μm滤膜过滤后测定。有关物质A、B、C的平均回收率分别为113.2%（RSD=2.9%；n=9）、107.5%（RSD=3.0%；n=9）、101.1%（RSD=2.8%；n=9）。表明本法的准确度较好。
3.6.5 稳定性精密量取有关物质准确度储备液0.5 mL，置50 mL量瓶中，用运行缓冲液稀释至刻度，作为有关物质准确度溶液，分别于0、2、4、6、8、12、24、36 h按照“2.2项”的电泳条件进行测定，有关物质A、B、C峰面积的RSD分别为4.0%、3.1%、4.4%。表明本法的稳定性较好。
4 讨论毛细管电泳方法根据分析产物电荷和质量不同，利用电渗流梯度分离的原理进行分析的一种色谱方法。本实验建立了一个针对雷尼替丁注射液的分析时间少于13 min，相比法定标准液相色谱的梯度条件节约2/3的时间，避免了高盐流动相对仪器损伤的替代的毛细管电泳分析方法，并且分析的性能经验证与液相色谱系统相当。存在唯一的不足之处是毛细管系统稳定性与液相系统还有部分差距，这主要是毛细管电泳的分析机理所致。毛细管电泳具有样品取用量少（一般为纳升），处理过程简单，溶剂消耗少并且溶剂多为无环境破坏的水性溶液等优点，特别是针对水溶性样品，毛细管电泳具有极大的优势，同时通过向运行缓冲液中添加有机溶剂、手性试剂、表面活性剂等改性试剂，可以分析更多类型的样品。随着毛细管仪器的改进，毛细管电泳仪的精密度和稳定性已有了较大的提高。本文建立的方法可作为盐酸雷尼替丁注射液分析的补充方法，也为盐酸雷尼替丁其他制剂的含量测定以及有关物质的分析提供了技术支持。
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