2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
乳酸（lactic acid）是一种具有良好生物相容性的有机酸，常作为酸味剂和pH调节剂应用于食品、化妆品、药品及化学应用中[1，3]。其分子中含有1个手性碳原子，故存在L（+）-乳酸和D（-）-乳酸2种对映异构体。L-乳酸在肝脏中可通过L-乳酸脱氢酶的作用快速代谢为丙酮酸，但哺乳类动物体内缺乏D-乳酸脱氢酶[2]，D-乳酸的代谢是通过D-α-乳酸脱氢酶的作用且代谢速率仅为L-乳酸脱氢酶的1/5[3]，若外源性过量摄入D-乳酸，可能会对人体代谢有害并造成酸中毒及脱钙[4-6]。WHO明确规定，人体每天摄取的D-乳酸的量限制在每千克体重在100 mg以下，而不限制L-乳酸的用量[7]。
奥曲肽（octreotide）是由Bauer等[8]于1982年合成的一种生长抑素类似物，为八肽环状化合物。在临床上广泛应用于肢端肥大症、消化道肿瘤等的治疗。目前国内生产的醋酸奥曲肽注射剂主要有醋酸奥曲肽注射液及注射用醋酸奥曲肽2种，两者处方中的辅料均包含乳酸。将醋酸奥曲肽注射剂中乳酸的2种对映异构体进行拆分后确定其中D-乳酸的含量对该制剂的临床使用安全性具有重要意义。
采用普通的有机酸色谱柱无法区分乳酸2种对映体[9]，且使用文献[9-14]的色谱条件对醋酸奥曲肽注射剂测定时会出现干扰峰，故本文建立了HPLC法，采用手性色谱柱对L-乳酸和D-乳酸进行拆分及定量，该方法操作简便、重复性好，可监测该品种中乳酸的添加情况，确保该产品的安全性。
1 仪器与试药Waters 2695高效液相色谱仪，Waters 2996二极管阵列检测器及Waters 2487紫外检测器，Empower色谱工作站；Sartorius BP211D电子天平；Millipore去离子水发生装置（德国Merck Millipore）。色谱柱为手性柱Phenomenex Chirex 3 126（D）-penicillami（4.6 mm × 250 mm），固定相为（D）-penicillami，填料为Fully Porous Silica。
L（+）-乳酸对照品（Sigma-alorich，批号SLBB4580V，含量98%）；D（-）-乳酸对照品（Sigma-alorich，批号SLBM4484V，含量100%）。醋酸奥曲肽注射液（2015年国家评价性抽验样品，来源于11家企业，70批次，规格1 mL:0.05 mg、1 mL:0.1 mg、1 mL:0.15 mg、1 mL:0.2 mg及1 mL:0.3 mg）；注射用醋酸奥曲肽（2015年国家评价性抽验样品，来源于6家企业，21批次，规格0.1 mg及0.3 mg）；醋酸奥曲肽注射液（诺华制药，批号S0369，规格0.1 mg·mL-1）。硫酸铜为分析纯，异丙醇为色谱纯，水为去离子水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件色谱柱为手性柱Phenomenex Chirex 3126（D）-penicillami（4.6 mm × 250 mm），固定相为（D）-penicillami，填料为Fully Porous Silica；流动相为2 mmol·L-1硫酸铜溶液（溶剂为2 %异丙醇溶液），流速1.0 mL·min-1，UV检测器，检测波长230 nm，柱温35 ℃，进样量10 μL。
2.2 溶液制备混合对照品溶液：精密称取L（+）-乳酸、D（-）-乳酸对照品适量，加流动相溶解并稀释制成浓度分别为2.0 mg·mL-1、30.0 μg·mL-1的溶液。
供试品溶液：取醋酸奥曲肽注射液原液作为供试品溶液；取注射用醋酸奥曲肽1瓶，加水1 mL溶解作为供试品溶液。
2.3 系统适用性精密量取“2.2”项下混合对照品溶液，进样10 μL，记录色谱图，结果色谱图中两种成分出峰顺序依次为L-乳酸、D-乳酸（见图 1），两峰间分离度大于1.5。
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1. L-乳酸（L-lactic acid）2. D-乳酸（D-lactic acid） 图 1 系统适用性试验溶液HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatogram of system suitability test |
精密量取流动相10 μL进样，得空白溶剂色谱图；按醋酸奥曲肽注射剂处方量制备空白辅料溶液（不含乳酸），进样10 μL并记录色谱图（图 2）。结果表明空白溶剂及辅料对测定均无干扰。
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A.空白辅料（blank excipient）B.空白溶剂（blank solvent） 图 2 专属性试验色谱图 Figure 2 Chromatogram of specificity test |
精密称取L（+）-乳酸、D（-）-乳酸对照品适量，加流动相溶解并稀释制成浓度分别为5.0 mg·mL-1、50.0 μg·mL-1的溶液。精密量取该溶液，逐级稀释成含L-乳酸浓度为0.51、1.02、1.52、2.03、2.53、3.05 mg·mL-1；含D-乳酸浓度为4.19、8.38、16.76、28.49、33.52、41.90 μg·mL-1的系列对照品溶液，分别进样10 μL，记录色谱图，以峰面积Y为纵坐标，进样浓度X（μg·mL-1）为横坐标进行线性回归，得L-乳酸的回归方程（n=6）：
Y=7.377×106X-4.187×104 r=1.000
D-乳酸的回归方程（n=6）为：
Y=5.916×103X-2.119×103 r=0.999 7
结果表明，L-乳酸浓度在0.51 mg·mL-1 ~3.05 mg·mL-1范围内，D-乳酸浓度在4.19 μg·mL-1~41.90 μg·mL-1范围内，均与峰面积的线性关系良好。
2.6 精密度与重复性试验取“2.2项下”混合对照品溶液连续进样6次，L-乳酸、D-乳酸峰面积的RSD分别为0.2%和0.9%。结果表明该方法精密度良好。
取同一批样品（醋酸奥曲肽注射液，批号150401）共6份，分别进样10 μL，记录色谱图。计算L-乳酸及D-乳酸的平均含量（n=6）分别为2.09 mg·mL-1和34.62μg·mL-1，RSD分别为0.5%和1.2%，结果表明样品的重复性良好。
2.7 定量限与检测限逐级稀释“2.2项下”混合对照品溶液，测得L-乳酸及D-乳酸的定量限（S/N = 10）分别为40.2 ng和41.9 ng；L-乳酸及D-乳酸的最低检测限（S/N =3）分别为12.1 ng和14.2 ng。
2.8 稳定性试验取供试品溶液（醋酸奥曲肽注射液，批号150401），按上述色谱条件测定并记录色谱图，分别以L-乳酸及D-乳酸的峰面积为指标考察溶液稳定性。结果见表 1，L-乳酸及D-乳酸峰面积的RSD分别为0.3%和0.6%，表明供试品溶液24 h内稳定性良好。
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表 1 稳定性试验结果 Table 1 Results of stability test |
按供试品处方配制空白辅料溶液（不含乳酸），再精密称取L（+）-乳酸及D（-）-乳酸对照品适量，加入上述空白辅料溶液溶解，分别配制低、中、高三水平的加样回收溶液，每个水平平行制备3份，进样10 μL，按外标法计算回收率，结果L-乳酸平均回收率（n=9）为100.9%，RSD（n=9）为0.7%；D-乳酸平均回收率（n=9）为99.8%，RSD（n=9）为0.6%，见表 2。
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表 2 回收率试验结果（n=3） Table 2 Results of recovery test |
对70批醋酸奥曲肽注射液、21批注射用醋酸奥曲肽及原研企业诺华公司的1批醋酸奥曲肽注射液样品进行乳酸2种对映异构体含量检查，结果为：70批醋酸奥曲肽注射液的L-乳酸含量为0.7~2.4 mg·mL-1（平均含量1.9 mg·mL-1），D-乳酸含量为6.8~35.9 μg·mL-1；21批注射用醋酸奥曲肽的L-乳酸含量为0.8~3.0 mg·mL-1（平均含量1.8 mg·mL-1），D-乳酸含量为4.3~40.6 μg·mL-1；诺华公司的1批醋酸奥曲肽注射液仅检出L-乳酸，含量为2.4 mg·mL-1。典型色谱图见图 3。
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1. L-乳酸（L-lactic acid）2. D-乳酸（D-lactic acid） A.醋酸奥曲肽注射液（octreotide acetate injection）B.注射用醋酸奥曲肽（octreotide acetate for injection） 图 3 醋酸奥曲肽注射剂中乳酸对映异构体HPLC色谱图 Figure 3 HPLC chromatogram of lactic acid enantiomers in the octreotide acetate injection and for injection |
手性配体交换色谱分离过程中，由于与Cu2+形成络合物，文献[9-14]多选择通用波长254 nm进行检测，但本文采用二极管阵列检测器对乳酸溶液进行全波长扫描，结果显示L-乳酸及D-乳酸的最大紫外吸收波长为230 nm，故选取230 nm作为检测波长，在此波长处两种对映体的灵敏度较254 nm处高。
3.2 流动相的选择目前对于手性药物的分离分析多采用手性配体交换色谱法（CLEC），即在色谱系统中引入某种金属离子和手性配体，与待测对映体配位可形成2个非对映的三元络合物，经色谱过程实现光学异构体的立体选择分离[15]。本文采用Chirex 3126（D）-penicillami手性柱是利用其固定相中的手性配体与Cu2+形成配合物后，再与对映体发生交换作用形成另一种配合物[16]，2种对映体与手性配体形成配合物的稳定程度不同决定其在色谱柱中的保留时间不同。手性柱常用硫酸铜水溶液作为流动相，且Cu2+浓度控制在0.2 ~3 mmol·L-1，增大Cu2+浓度或加入有机改性剂如异丙醇等均可缩短样品保留时间，提高峰形的对称性。
本文参照文献[9-14]及Chirex 3126（D）-penicillami手性色谱柱评价报告中使用的2 mmol·L-1硫酸铜溶液（溶剂为5 %异丙醇溶液）作为流动相，可实现L-乳酸及D-乳酸有效分离，但在D-乳酸峰后出现一杂质峰影响D-乳酸峰的积分，将流动相中的异丙醇含量降低后可消除该杂质峰且不影响乳酸对映体的灵敏度，故确定流动相为2 mmol·L-1硫酸铜溶液（溶剂为2 %异丙醇溶液）。
3.3 样品质量分析70批醋酸奥曲肽注射液（其中4批说明书中未添加乳酸）及21批注射用醋酸奥曲肽（其中11批说明书中未添加乳酸）除说明书中标识辅料无乳酸外，其余均检出乳酸2种光学异构体，除个别企业外，国内企业的醋酸奥曲肽注射剂处方中乳酸含量基本一致，且L-乳酸含量均远高于D-乳酸含量。本次抽验样品中检出的乳酸含量远低于WHO规定的人体每天摄取D-乳酸最大量100 mg·kg-1体重，表明国内企业生产的醋酸奥曲肽注射剂中辅料乳酸用量较低，在防止造成人体代谢性酸中毒方面可以保证该产品的安全性。原研企业诺华的注射液样品仅检出L-乳酸（2.4 mg·mL-1），含量略高于国内企业醋酸奥曲肽注射剂中L-乳酸含量（醋酸奥曲肽注射液L-乳酸平均含量1.9 mg·mL-1，注射用醋酸奥曲肽L-乳酸平均含量1.8 mg·mL-1）。虽然国产醋酸奥曲肽注射剂中D-乳酸含量较低，但为了避免外源性D-乳酸摄入后在人体内蓄积危害健康，建议提高国产醋酸奥曲肽注射剂中的辅料乳酸质量，保证制剂安全性。
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