2. 抗生素研究与再评价四川省重点实验室, 成都大学四川抗菌素工业研究所, 成都 610052
2. Antibiotics Research and Reevaluation Key Laboratory of Sichuan Province, Sichuan Industrial Institute of Antibiotics, Chengdu University, Chengdu 610052, China
头孢匹胺钠为半合成第三代头孢菌素类抗生素,对葡萄球菌、链球菌、消化链球菌等革兰阳性菌具有显著的抗菌作用[1-3],对铜绿假单胞菌等不酵解葡萄糖的革兰阴性杆菌也有一定的抗菌效果[4-5]。头孢匹胺钠抗菌作用强,抗菌谱广,疗效显著,优于第三代、第四代头孢菌素。日本药典(JP16)收载头孢匹胺钠的质量控制标准[6],美国药典(USP36-NF31)[7]收载的是头孢匹胺的质量控制标准,中国国家食品药品监督管理局颁布了头孢匹胺钠的试行标准[8-9]。以上标准的有关物质方法均为等度洗脱法。
头孢匹胺钠有关物质的种类数量与含量均与其生产制备工艺和起始原料的品质密切相关,由于国内外生产制备头孢匹胺钠的生产工艺路线以及起始原料的差别[10-14],因此目前国外的现行标准未必适用于国内头孢匹胺钠原料药产品的有关物质检查。而且,国外现行的头孢匹胺钠标准[6]:日本药典0.03 mol·L-1磷酸二氢钾(pH7.5)-甲醇(75:25),也有一定的缺陷:中间体和起始原料的极性较大,出峰快,各峰之间及各峰与主峰之间的分离较差,并且主峰与有关物质Ⅱ的分离较差等方面,调整有机相与缓冲液的比例虽可改善有关物质Ⅱ与主峰之间的分离度但仍未能改善中间体、起始原料峰之间分离度差的情况,如图 1所示。因此本研究建立了HPLC梯度洗脱方法,有效克服了分离度差的难题,并对方法进行了系统的验证。
同时,采用LC-MS技术,结合其生产制备工艺,对头孢匹胺钠中的关键有关物质进行了结构鉴定,并采用合成方法确证了有关物质Ⅱ结构的正确性。以上研究结果不仅有利于杂质对照品的准确定性和定量,并有利于其生产制备工艺的改进,进一步提高国产品种的质量。
1 仪器与试药岛津LC-20AT型高效液相色谱仪,Agilent6410B三重四极杆串联质谱仪,BrukerAvance 400MHZ核磁共振仪。头孢匹胺钠样品及头孢匹胺(四川抗菌素工业研究所化学事业部提供,批号分别为:20131127、120320及120131),乙腈为色谱纯,水为超纯水,其他试剂均为分析纯。色谱柱Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5 μm;填料:十八烷基硅烷键合硅胶;安捷伦仪器公司);色谱柱Agilent XDB-C18(4.6 mm×50 mm,1.8 μm;安捷伦仪器公司)。
2 方法和结果 2.1 HPLC方法的建立色谱条件:以Agilent C18(4.6 mm×250 mm,5μm;填料:十八烷基硅烷键合硅胶)为色谱柱;流动相:A:磷酸盐缓冲液(4.08g磷酸二氢钾溶于800 mL水中,用2 mol·L-1的氢氧化钠溶液调至pH7.5±0.1,用水稀释至1 000 mL)B:乙腈,梯度洗脱见表 1。检测波长:254 nm;柱温:35 ℃。供试品溶液浓度:0.5 mg·mL-1;进样体积:10 μL。
根据生产工艺[15~16],头孢匹胺钠产品中可能含有起始原料7-氨基头孢烷酸(7-ACA)、1-甲基-5-巯基四氮唑(MTTA-SH);3个中间体3-(1-甲基-1H-四唑-5-硫代甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(7-TMCA)、2-[(6-甲基-4-羟基吡啶-3-羰基)-氨基]-2-(4-羟基苯基)乙酸钠(NPA-Na)、(6R,7R)7-[(R)2-[(6-甲基-4-羟基吡啶-3-羰基)-氨基]-2-(4-羟基苯基)-乙酰氨基]-3-(1-甲基-1H-四唑-5-硫代甲基)-8-氧代-5-硫杂-1-氮杂双环[4.2.0]辛-2-烯-2-羧酸(CPM-H);有关物质Ⅱ为头孢匹胺异构体。分别取中间体7-TMCA、NPA-Na和起始原料7-ACA、MTTA-SH,以及有关物质Ⅱ头孢匹胺异构体,分别用流动相A溶解并稀释制成单一成分供试液,按“2.1”项下色谱条件分别进样,定位色谱峰;另外取头孢匹胺钠、上述原料、中间体及有关物质Ⅱ适量,用流动相A溶解并稀释制成混合溶液,按照“2.1”项下的色谱条件进样,记录色谱图如图 2,在建立的色谱条件下,头孢匹胺钠与各原料、中间体、有关物质Ⅱ及有关物质之间能完全分离。
酸降解试验:称取头孢匹胺钠样品(批号:20131127)约5 mg,置10 mL量瓶中,加2 mol·L-1的盐酸2 mL,室温放置15 min,加2 mol·L-1氢氧化钠溶液中和,加流动相A稀释制成每1 mL含有0.5 mg的溶液;碱降解试验:称取头孢匹胺钠样品约5 mg,置10 mL容量瓶中,加0.01 mol·L-1的氢氧化钠溶液2 mL,在95 ℃水浴加热10 min,加0.01 mol·L-1盐酸溶液中和,加流动相A稀释制成每1 mL含有0.5 mg的溶液;高温降解试验:称取头孢匹胺钠样品,置120 ℃恒温干燥箱中放置1 h,取出,放冷,称取5 mg置10 mL量瓶中,加流动相A稀释制成每1 mL含有0.5 mg的溶液。氧化降解试验:称取头孢匹胺钠约5 mg,置10 mL量瓶中,加10%双氧水2 mL,放置30 min,加流动相A稀释制成每1 mL含有0.5 mg的溶液。分别取上述降解后得到的各溶液按照“2.1”项下的色谱条件进行测定,结果见图 3,图谱显示,在所建色谱条件下,主成分头孢匹胺与相邻杂质峰,各中间体及降解产物峰均能达到良好的分离,物料基本平衡,说明所建方法的专属性强。
分别称取头孢匹胺对照品和有关物质Ⅱ各适量,精密称定,用流动相A溶解并稀释分别制成每1 mL含有头孢匹胺41.98 mg和有关物质Ⅱ 43.89 mg溶液,依次稀释,按“2.1”项下的色谱条件进行测定,记录峰面积。以峰面积(Y)对头孢匹胺和有关物质Ⅱ浓度(X)分别进行线性回归,头孢匹胺和有关物质Ⅱ回归方程分别为:
Y=3.510×104X+668.4 R2=1.000
Y=3.230×104X-143.8 R2=0.999 8
结果表明,头孢匹胺和有关物质Ⅱ分别在1.31~ 41.98 mg·mL-1和0.03~43.89 mg·mL-1浓度范围内呈良好的线性关系。
2.4 检测限与定量限研究通过逐级降低浓度进样测定,按信噪比10:1计算,有关物质Ⅱ的定量限为0.14 mg·mL-1,约为有关物质检查量的0.03%;按信噪比3:1计算,有关物质Ⅱ检测限为0.07 mg·mL-1,约为有关物质检查量的0.01%。表明本法具有较高的灵敏度。
2.5 精密度试验精密称取本品适量,用流动相A溶解并稀释制成每1 mL含头孢匹胺0.5 mg的溶液,在上述色谱条件下,连续进样6次,主峰头孢匹胺峰面积RSD=0.11%,结果表明精密度良好。
3 杂质结构解析 3.1 杂质结构的初步推断从头孢匹胺钠的HPLC色谱图 5-A、5-C中可以看出,在头孢匹胺主峰前存在多个杂质,其中有关物质Ⅱ与主峰相邻较近(相对保留时间为0.89),对分析方法的专属性有显著影响,而且其含量较高( > 0.1%),是本品的关键性杂质。因此,采用LC-MS的方法对头孢匹胺钠及有关物质Ⅱ进行LC-MS分析,对有关物质Ⅱ的结构进行鉴定,并采用合成方法确证了有关物质Ⅱ结构的正确性。
色谱条件:色谱柱:Agilent XDB-C18柱(4.6 mm×50 mm,1.8 μm),流动相:0.01 mol·L-1甲酸铵缓冲溶液(pH6.5未调)-乙腈(90:10),检测波长:254 nm,流速:0.4 mL·min-1,柱温:30 ℃。
质谱条件:Agilent6410B三重四极杆串联质谱仪;电喷雾ESI离子源;检测模式:ESI(+);干燥气流速:10 L·min-1;干燥气温度:340 ℃,喷雾器:275.8 kPa。
结果如图 4:有关物质Ⅱ与主峰分离良好,有关物质Ⅱ的分子离子峰[M+H]+的质荷比为613.3,头孢匹胺钠分子离子峰[M+H]+的质荷比为613.1,有关物质Ⅱ与头孢匹胺钠的分子量一致;且有关物质Ⅱ与头孢匹胺钠的二级质谱碎片峰相吻合,提示其质谱裂解途径相同[17]。因此推断有关物质Ⅱ为头孢匹胺钠异构体。
采用定向合成方法确证了有关物质Ⅱ结构的正确性。参考头孢匹胺钠的合成路线和方法[15],用L-(+)对羟基苯甘氨酸代替D-(-)对羟基苯甘氨酸,合成7位侧链上手性碳为S型的头孢匹胺异构体(纯度96.17%)。
采用加样回收法进一步验证了有关物质Ⅱ为头孢匹胺钠异构体。将该异构体样品定量地添加到头孢匹胺钠样品溶液中,分别在等度洗脱和梯度洗脱2种色谱条件下进行进样分析,结果表明该异构体色谱峰与头孢匹胺钠供试品溶液中有关物质Ⅱ的色谱峰保留时间一致,色谱峰完全重叠,峰面积等量增大,见图 5。因此确定合成获得的异构体杂质为头孢匹胺钠样品中存在的有关物质Ⅱ。
3.2 有关物质Ⅱ结构鉴定数据有关物质Ⅱ与头孢匹胺的1H-NMR对比如下,可看出有关物质Ⅱ氢原子的化学位移及分裂情况与头孢匹胺基本一致,18位、10位碳上氢和7位碳上氢峰裂分略有不同,推测有关物质Ⅱ为头孢匹胺异构体。结构式见图 6。
按照日本药典方法[6]对工艺生产的样品进行分析,发现头孢匹胺钠的起始原料(7-ACA)及中间体7-TMCA、NPA-Na未达到基线分离,难以为生产控制提供准确的依据,本建立的梯度方法能将主峰与杂质,杂质与杂质之间有效分离。鉴于梯度洗脱法已广泛用于抗生素药物的有关物质控制,且建立的梯度洗脱方法优于等度方法,能更好的控制药品的质量,故在进一步研究的基础上本法可作为头孢匹胺钠质量标准提升的参考方法。
4.2 推测杂质Ⅰ结构杂质Ⅰ与主峰相邻较近(相对保留时间为0.89),对分析方法的专属性有显著影响,而且其含量较高( > 0.1%),是本品的关键性杂质。通过对有关物质Ⅱ与头孢匹胺的LC-MS分析对比研究,可知有关物质Ⅱ的分子量与头孢匹胺钠相同,且具有相同的碎片离子峰,提示两者具有相同的裂解途径,推测有关物质Ⅱ为头孢匹胺钠的异构体。进一步采用定向合成的方法得到有关物质Ⅱ的样品,确证其结构推测的正确性。
4.3 确证杂质Ⅰ结构对有关物质Ⅰ和头孢匹胺的核磁共振氢谱比较研究。有关物质Ⅱ化学位移及分裂情况与头孢匹胺基本一致,可能受到10位手性碳的影响,仅18、10位碳上氢和7位碳上氢峰裂分略有不同,进一步证实了有关物质Ⅱ为头孢匹胺异构体。
【致谢:感谢四川抗菌素工业研究所陈林副研究员在杂质合成过程中的指导和帮助。】
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