2017, Vol. 37 
去羟肌苷（didanosine，2’，3’-双脱氧肌苷，见图 1）是一种嘌呤核苷类逆转录酶抑制剂，竞争性地抑制逆转录病毒对自然底物三磷酸双脱氧腺苷作用，中止DNA链的延长，从而阻碍HIV病毒的复制增殖。临床上主要用于治疗齐多夫定（AZT）不耐受、无效或无症状HIV感染的艾滋病患者[1-7]。合成工艺以肌苷为起始原料，经过溴化反应、消除反应、氢化反应得到去羟肌苷，其有关物质的分析鉴定研究尚未见报道。
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图 1 去羟肌苷结构 Figure 1 Chemical structure of didanosine |
本文采用液相-质谱联用技术对其有关物质进行进行鉴定研究，并进行强制破坏试验。去羟肌苷在酸破坏条件下不稳定，主要破坏产物为次黄嘌呤，在碱、光照及高温条件下较为稳定[8-9]，对原料中8个主要有关物质进行了结构鉴定[10-14]，其中3个有关物质并未见报道，可为其质量控制提供参考依据。
1 仪器与试药Shimadzu LC2010液相色谱仪，LC Solution工作站；Agilent 1 260 Infinity液相色谱-6224飞行时间质谱仪，MassHunter工作站；ThermoFinnigan TSQ Quantum Ultra AM型LC-MS/MS联用仪；Xcalibur工作站。Sartorius BS21S电子天平。去羟肌苷对照品（批号：14703-200401，含量99.7%），次黄嘌呤（杂质A，批号：140661-200903，含量99.5%），肌苷（杂质B，批号：140669-201104，含量100%）均购自中国食品药品检定研究院；2’-去氧肌苷（杂质C，批号：D239755，含量98%），3’-去氧肌苷（杂质D，批号：D239760，含量98%），2’，3’-脱水肌苷（杂质E，批号：A648370，含量97%）均购自Toronto Research Chemicals公司；2’，3’-二去氧-2’，3’二去氢肌苷（杂质F，批号：RGT8936，含量99%）购自深圳市瑞吉特生物科技有限公司；系统适用性试验对照品（批号：69655-05-6，含去羟肌苷98.4%，杂质A 0.5%，杂质B 0.2%，杂质C 0.3%，杂质D 0.2%，杂质E 0.2%，杂质F 0.2%，USP对照品）；去羟肌苷原料（批号：20121001、20121002、20121003）由河南天方药业股份有限公司提供；甲醇和乙腈为色谱纯，实验用水为超纯水。
2 方法与结果 2.1 色谱条件参照ChP2015选择如下色谱条件[12]。InertSurstain C18（250 mm×4.6 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键含硅胶）色谱柱，以0.386%醋酸铵溶液加氨水调节pH至8.0为流动相A，以乙腈-甲醇（50：50）为流动相B，进行线性梯度洗脱（A-B）0 min（92：8）→15 min（92：8）→30 min（70：30）→45 min（70：30）→50 min（92：8）→60 min（92：8），检测波长254 nm，进样体积20 μL，柱温25 ℃。
2.2 质谱条件TOF/MS质谱条件：Dual ESI正离子扫描，雾化气压力350 kPa，温度350 ℃，干燥气流量10 L·min-1，毛细管电压4 kV，碎片电压100 V，参比离子m/z 121.050 8和922.009 7，质量数扫描范围m/z 100~1 200。
MS/MS质谱条件：喷雾电压5 kV，雾化气压310 kPa，辅助气压力35 kPa，毛细管温度350 ℃，二级质谱扫描碰撞氩气压力0.20 Pa，碰撞能量25 eV。
2.3 系统适用性试验精密称取系统适用性试验对照品适量，加稀释液（流动相A－B=90：10）溶解并定量稀释制成含去羟肌苷0.5 mg·mL-1的溶液，按‘2.1’色谱条件，精密量取20 μL注入液相色谱仪，记录色谱图，见图 2-a。
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Ⅰ~Ⅶ.杂质峰编号（No.of impuritley peaks）A~F.杂质A-F（impurities A-F） 图 2 系统适用性（a）、酸破坏溶液（b）和原料（c）有关物质检查色谱图 Figure 2 Chromatograms for related substancesof system suitability solution(a), acid stress solution(b)and didanosine(c) |
测得理论板数按去羟肌苷峰计算为6 589，杂质C峰与杂质D峰间的分离度为3.8。
2.4 有关物质检查精密称取去羟肌苷原料25 mg，置50 mL量瓶中，用稀释液溶解并稀释至刻度，摇匀，作为供试品溶液。按照“2.1”项色谱条件进行试验HPLC-UV色谱图中共显示有8个主要有关物质峰（杂质编号为Ⅰ~Ⅷ），见图 2-c。由于去羟肌苷在强碱、高温、和光照条件下较稳定，在酸性条件下降解产物较多[5]，酸破坏溶液色谱图，见图 2-b。结果显示去羟肌苷有关物质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅷ可能为降解杂质，有关物质Ⅰ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅸ可能由生产过程中代入。有关物质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ的液相色谱相对保留时间与USP系统适用性溶液中杂质A~E的相对保留时间一致，杂质F未检出，结果见表 1~2。
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表 1 去羟肌苷有关物质的ESI-TOF/MS高分辨测定结果 Table 1 Accurate mass results of the relatedsubstances of didanosine by ESI high resolution TOF/MS |
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表 2 去羟肌苷有关物质MS/MS二级碎片 Table 2 The MS/MS fragments of the related substances of didanosine |
按“2.1”、“2.2”项所述条件，对去羟肌苷有关物质进行ESI高分辨TOF/MS检测，测定各有关物质的精确离子质量，设置杂质组成为C、H、O、N并通过Mass Hunter软件匹配计算其离子式，质量偏差均小于3×10-6。
结果显示去羟肌苷有关物质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ的精密质量及相对保留时间与已知杂质A~E一致，结果见表 1。
2.5.2 有关物质MS/MS结构鉴定按“2.2”所述质谱条件，测得去羟肌苷有关物质Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅵ、Ⅶ二级质谱碎片与杂质A~E的二级质谱碎片一致，结合相对保留时间和TOF/MS测定的结果，推测去羟肌苷原料中含有5个已知杂质和3个未知杂质，MS/MS主要碎片离子见表 2。3个未知杂质二级质谱图见图 3。去羟肌苷裂解途径见图 5-a，已知杂质A~F裂解途径见图 5-b~g。
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图 3 杂质Ⅰ（a）、Ⅴ（b）、Ⅸ（c）[M+H]+离子的二级质谱图 Figure 3 MS/MS spectra of [M+H]+ ions of impurity Ⅰ(a), impurity Ⅴ(b)and impurity Ⅸ(c) |
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a.去羟肌苷（didanosine）b. Ⅱ（A）c. Ⅲ（B）d. Ⅳ（C）e. Ⅵ（D）f. Ⅶ（E）g. Ⅲ（F）h. Ⅰ i. Ⅴ j. Ⅸ[A~F.同图 4（same as |
有关物质Ⅰ为未知杂质，其准确分子量为240.088 1，通过TOF/MS得到的分子式为C9H12N4O4，主要特征碎片离子为m/z 177、m/z 159、m/z 140与m/z 99，见图 3-a。杂质可能是生产过程中带入，m/z 177为母离子脱去一分子H2O（18 amu）和1分子HCOOH（46 amu），m/z 159为m/z 177脱去一分子H2O（18 amu），m/z 140为母离子开环后脱去1分子HCOOH（46 amu）、一分子CO（28 amu）和一分子HCN（17 amu）得到，m/z 99为母离子开环后得到。有关物质Ⅱ可能为9-（2-氧基-丁酸）-1，4，5，7，8，9-六氢-嘌呤-6-酮，裂解途径见图 4-h。
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A~F.杂质A~F（impurity A-F） 图 4 系统适用性溶液色谱图（EP9.0） Figure 4 HPLC chromatogram of system suitability solution |
有关物质Ⅴ为未知杂质，其准确分子量为194.043 5，通过TOF/MS的到的分子式为C7H6N4O3，主要特征碎片离子为m/z 177、m/z 163、m/z 149与m/z 137，见图 4-b。m/z 177为母离子脱去一分子H2O（18 amu），m/z 149为m/z 177脱去一分子CO（28 amu），m/z 163为母离子脱去一分子CH3OH（32 amu），m/z 137说明母离子与次黄嘌呤有相同的结构。有关物质Ⅴ可能为9-（2-羟基-乙酰基）-1，9-双氢-嘌呤-6-酮，裂解途径见图 4。
有关物质Ⅸ为未知杂质，其准确分子量为336.144 2，通过TOF/MS的到的分子式为C15H20N4O5，主要特征碎片离子为m/z 263、m/z 203、m/z 183、m/z 137与m/z 101，见图 3-c。m/z 263为母离子脱去一分子CH3CH2COOH（74 amu），m/z 203为母离子脱去CH3CH2OH（46 amu）和一分子CH3CH2COOCH3（88 amu），m/z 183为母离子脱去一分子H2O（18）及次黄嘌呤（136 amu），m/z 137说明母离子与次黄嘌呤有相同的结构，通过去羟肌苷原料的合成路线，与碎片离子的质荷比，有关物质物质Ⅸ的可能为9-（3-乙氧基-4-丙酸甲酯-四氢呋喃）-1，9-双氢-6H-嘌呤-6-酮，裂解途径见图 5。
3 讨论按照EP 9.0中去羟肌苷原料有关物质检查色谱条件[15]，采用不同厂家的3根色谱柱进行测定，杂质C、D、E之间的分离较差，杂质D与E的相对保留时间分别为0.52和0.50（EP9.0正文中规定杂质D与E的相对保留时间为0.48、0.5），出峰顺序与正文描述的相反，见图 4，并通过LC-TOF/MS对结果进行了确认。采用液相色谱-质谱连用技术对去羟肌苷原料中3个未知杂质的结构鉴定，可以为其质量控制提供参考依据。
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