2017, Vol. 37 
表3(Table 3)
米铂属于第三代铂类抗肿瘤药物，抗癌谱广、疗效确切[1]。目前米铂仅有一种上市剂型：米铂混悬注射液（Miripla®，Dainippon Sumitomo Pharma，Osaka，Japan）。此制剂只能通过肝动脉栓塞给药用于肝癌的介入性治疗，极大地限制了米铂的临床应用[2-3]。米铂脂质体的成功构建为实现米铂的多元化给药、拓展米铂的临床适应症带来了新的希望，是一种有望进入临床的米铂新剂型。
米铂自身特殊的理化性质增加了米铂定量分析的难度。首先，米铂几乎不溶于水（≤2.6 μg·mL-1）[4]和乙腈（≤2.6 μg·mL-1），极微溶于甲醇（0.614mg·mL-1）；此外，米铂溶液与常用的缓冲盐溶液（如磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等）混合后即刻发生固体析出现象。以上诸因素都不利于米铂的含量测定方法学研究与验证。同时也尚未见米铂纳米制剂中米铂分析方法的相关报道，因此需要建立米铂脂质体中米铂的含量测定法，便于米铂脂质体的定量分析。
本研究建立了简便、专属性强的HPLC法，依据ICH相关指导原则对该法进行了系统的方法学验证[9-11]，证明该法适用于米铂脂质体的含量测定。本法对其他米铂纳米制剂的含量测定也具有参考价值。
1 仪器与试药高效液相色谱仪（e2695型，Waters公司）；色谱柱（C8：辛烷基硅烷键合硅胶为填充剂，250 mm×4.6 mm，5 μm；安捷伦科技有限公司）；旋转蒸发仪（OSB-2100型，日本东京理化器械株式会社）；分析天平（XSE105，梅特勒公司）；数控超声波清洗器（KQ-250DB型，昆山市超声仪器有限公司）；低温光照仪（药物制剂国家研究中心）。
米铂脂质体（自制，批号160601、160602、160603、160604、160605，中国医学科学院医药生物技术研究所制剂室）；米铂（工作对照品，100.9%，昆明贵研药业有限公司；原料药，100.9%，批号M20140203，昆明贵研药业有限公司）；聚乙二醇二硬脂酸磷脂酰乙醇胺（PEG2000-DSPE，注射级，批号B50845，上海艾韦特医药科技有限公司）；胆固醇（注射级，批号B40333，上海艾韦特医药科技有限公司）；5%葡萄糖注射液（批号E14012220，山东华鲁制药有限公司）；甲醇（色谱纯，Fisher Scientific有限公司）；其他试剂也均为色谱纯。
2 含量测定方法 2.1 样品液制备 2.1.1 米铂脂质体利用薄膜分散法制备米铂脂质体。精密称取处方量的米铂、磷脂材料及胆固醇，减压蒸发得均匀薄膜后，加入5%葡萄糖溶液水化、超声，即得。空白脂质体的制备同法操作，仅不加米铂。
2.1.2 米铂对照溶液精密称取米铂5 mg，置于100 mL量瓶中，加甲醇少许，超声使米铂完全溶解，再用甲醇稀释至刻度，摇匀，即得（50 μg·mL-1米铂对照溶液）。
2.1.3 供试品溶液及空白对照溶液精密量取0.1 mL米铂脂质体溶液，置于2 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，充分震荡、摇匀，离心（12 000 g，4 ℃，10 min），上清液即为供试品溶液。另精密量取0.1 mL空白脂质体，同法操作，得空白对照溶液。
2.2 色谱条件色谱柱：Agilent C8（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流动相：甲醇-水（92：8）；流速1.0 mL·min-1；检测波长210 nm；柱温30 ℃；进样量20 μL。
3 方法学考察 3.1 专属性试验 3.1.1 系统适用性分别取“2.1.2”和“2.1.3”项下米铂对照溶液、供试品溶液及空白对照溶液适量，照“2.2”项下色谱条件操作，记录色谱图（图 1）。在米铂对照溶液及供试品溶液中，米铂的保留时间均为15.8 min，且与14.5 min处脂质体辅料成分胆固醇的色谱峰完全达到基线分离，分离度为2.91。同时空白脂质体对应色谱图中15.8 min处未见干扰峰。上述结果表明在已建立的色谱条件下，米铂脂质体的辅料对米铂的测定无干扰，方法专属性良好。
|
1.米铂（miriplatin）2.胆固醇（cholesterol） a.米铂对照溶液（miriplatin reference substance）b.空白脂质体（blank liposome）c.米铂脂质体（lipomiriplatin） 图 1 系统适用性色谱图 Figure 1 Chromatograms of system suitability |
分别取米铂脂质体、空白脂质体、米铂对照溶液各5份，进行以下破坏性试验[12-14]。
3.1.2.1 酸破坏向米铂脂质体中加入1 mol·L-1盐酸溶液1 mL进行酸破坏试验，加入盐酸后米铂脂质体立即出现白色沉淀，表示米铂脂质体对酸极不稳定，故无法进行酸破坏性试验研究。
3.1.2.2 碱破坏精密量取4 mL米铂脂质体，向其中加入1 mol·L-1氢氧化钠溶液1 mL得到米铂浓度为2 mg·mL-1的溶液，室温下避光放置3 h。按“2.1.3”项下方法操作，得碱破坏供试品溶液。另分别精密量取4 mL空白脂质体和米铂对照溶液，同法操作，得碱破坏空白对照溶液及碱破坏米铂对照溶液。
3.1.2.3 氧破坏精密量取4 mL米铂脂质体，向其中加入3%过氧化氢溶液1 mL，得到米铂浓度为2 mg·mL-1的溶液，室温下避光放置3 h。按“2.1.3”项下方法操作，得氧破坏供试品溶液。另分别精密量取4 mL空白脂质体和米铂对照溶液，同法操作，得氧破坏空白对照溶液及氧破坏米铂对照溶液。
3.1.2.4 光破坏精密量取4 mL米铂脂质体，向其中加入5%葡萄糖溶液1 mL，得到米铂浓度为2 mg·mL-1的溶液，在低温光照仪[（4 500 ± 500）lx]中照射8 h。按“2.1.3”项下方法操作，得光破坏供试品溶液。另分别精密量取4 mL空白脂质体和米铂对照溶液，同法操作，得光破坏空白对照溶液及光破坏米铂对照溶液。
3.1.2.5 高温破坏精密量取4 mL米铂脂质体，向其中加入5%葡萄糖溶液1 mL，得到米铂浓度为2 mg·mL-1的溶液，在65℃水浴中避光加热6 h。按“2.1.3”项下方法操作，得高温破坏供试品溶液。另分别精密量取4 mL空白脂质体和米铂对照溶液，同法操作，得高温破坏空白对照溶液及高温破坏米铂对照溶液。
3.1.2.6 结果分别取以上各待测溶液，照“2.2”项下条件进样，记录色谱图（图 2）。结果表明：米铂色谱峰与碱、氧、光、高温破坏产生的降解产物色谱峰均能有效分离，说明本方法专属性良好。
|
1.米铂（miriplatin）2.胆固醇（cholesterol） a.米铂脂质体（lipomiriplatin）b.空白脂质体（blank liposome）c.米铂对照溶液（free miriplatin） A.碱破坏（destruction by strong base）B.氧破坏（destruction by oxidation）C.光破坏（destruction by illumination）D.高温破坏（destruction by high temperature） 图 2 破坏性试验色谱图 Figure 2 Typical chromatograms of destructive test |
精密称取米铂对照品适量，用甲醇溶解，并递倍稀释，得8种不同浓度的米铂溶液（浓度范围为3.37~115.11 μg·mL-1）。照“2.2”项下条件操作，记录峰面积，以米铂峰面积A为纵坐标，米铂浓度C为横坐标进行线性回归，得回归方程：
| $ \mathit{A}{\rm{ = 7}}\;{\rm{955}}\mathit{C}{\rm{ + 0}}{\rm{.159}}\;{\rm{6}}\;\;\;\;\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{9}} $ |
结果表明：在3.37~115.11 μg·mL-1范围内米铂浓度与峰面积呈良好的线性关系。
3.3 检测限与定量限精密量取米铂脂质体适量，用5%葡萄糖溶液递倍稀释，照“2.1.3”项下方法处理样品，照“2.2”项下条件，进样，并记录峰面积，分别以信噪比为3：1和10：1时相应的米铂的量为检测限和定量限。经检测，米铂的检测限为18.8 ng（S/N=3），定量限为67.4 ng（S/N=10）。
3.4 重复性试验取同一米铂脂质体6份，照“2.1.3”项下方法处理样品，照“2.2”项下条件进样，并记录峰面积，照“2.3”项下方法统计，米铂浓度的RSD=0.94%（n=6）。
3.5 精密度试验取同一米铂脂质体，照“2.1.3”项下方法处理样品，照“2.2”项下条件，同1天内连续进样6次记录米铂峰面积，照“2.3”项下方法统计，得米铂浓度的日内精密度RSD为0.75%（n=6）。另取同一份米铂脂质体，连续6 d，每天同法处理并平行连续进样3次，得米铂浓度的日间精密度RSD为1.0%（n=6）。
3.6 回收率试验精密称取米铂5.5、5.0、4.5 mg各3份，分别置于50 mL量瓶中，加甲醇适量并超声使米铂完全溶解，再加空白脂质体溶液2.5 mL，用甲醇定量至刻度，摇匀，离心（12 000g，4℃，10 min）得高、中、低3个浓度的供试品溶液[15-16]。照“2.2”项下条件，分别进样，记录峰面积，按外标法求得米铂实测值与理论值对比，每个浓度平行测定3次，求得平均回收率为97.1%（RSD=0.90%，n=3）、97.0%（RSD=0.10%，n=3）和98.7%（RSD=0.59%，n=3）（表 3）。
|
表 3 回收率试验结果统计 Table 3 Summary of recovery results |
将流速分别设置为0.99、1.00、1.01 mL·min-1，取同一份供试品溶液，照“2.2”项下条件，记录米铂保留时间与峰面积并依据外标法求得米铂浓度。结果：米铂浓度的RSD为0.49%（n=9）（表 4）。说明流速在0.99~1.01 mL·min-1范围内变化时方法的耐用性良好。
|
|
表 4 耐用性试验结果统计 Table 4 Robustness results under slightly changes of flow rate and column temperature |
将柱温分别设置为28 ℃、30 ℃、32 ℃，取同一份供试品溶液，照“2.2”项下条件，记录米铂保留时间与峰面积并依据外标法求得米铂浓度。结果：米铂浓度的RSD为1.7%（n=9）（表 4）。说明柱温在28~32 ℃之间变化时对米铂含量测定结果的影响在可接受范围内。
3.8 含量测定取5个不同批次的米铂脂质体，分别按“2.1.3”项下方法处理，照“2.2”项下条件，记录色谱图，并按照外标法计算各批次米铂脂质体中米铂的浓度，结果见表 5。
|
|
表 5 对5批米铂脂质体含量测定结果（μg·mL-1） Table 5 Content determination for five batches of lipomiriplatins |
本研究之初，首先建立米铂原料药的检测方法。通过分析米铂的化学结构发现：米铂极性较强，在常用的色谱柱上保留行为不佳，因此尝试利用缓冲盐溶液作为水相来改善米铂在液相系统中的保留行为以获得较理想的米铂色谱峰。结果发现：一旦米铂溶液与常用的缓冲盐系统（如磷酸盐缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、醋酸盐缓冲液等）接触就会产生沉淀，柱压突增，因此只能选择水作为液相系统的水相。
4.2 选用安捷伦C8色谱柱水作为水相，同时结合不同有机相，对多个厂家（Waters、迪马、安捷伦等）、不同类型的色谱柱（氨基柱、C18柱、C8柱等）进行了筛选，得到的色谱图见图 3。从色谱图可以看出，米铂对应的色谱峰在氨基柱上出现拖尾情况（图 3-A-a，图 3-A-b）；在C18色谱柱上出现前沿情况（图 3-B），说明氨基柱、C18柱不适用于米铂含量的测定。最后利用甲醇-水（95：5）为流动相，在C8色谱柱上获得了峰形对称、分离度良好、响应度较高的米铂色谱峰（图 3-C）。
|
A.氨基柱[a.迪马，流动相为100%甲醇；b.安捷伦，流动相为甲醇-水（95：5）][amino-bonded column from a. DiKMA with 100% methanol as mobile phase，and from b. Agilent with methanol and water（95：5，v/v）as mobile phase] B. C18色谱柱：Waters，流动相为甲醇-水（95：5）[C18-bonded column from Waters with methanol and water（95：5，v/v）as mobile phase] C. C8色谱柱：安捷伦，流动相为甲醇-水（95：5）[C8-bonded column from Agilent with methanol and water（95：5，v/v）as mobile phase] 图 3 不同类型色谱柱上得到的米铂原料药色谱图 Figure 3 Chromatograms of free miriplatin obtained using different types of chromatographic columns from different companies |
利用米铂原料药含量测定的色谱方法（C8色谱柱，流动相为甲醇-水（95：5））测定米铂脂质体中米铂的含量时，发现米铂脂质体中米铂的含量测定结果总是远远高于理论值，并且测定值与理论值之间并没有严格的量效关系；经观察发现所谓的“米铂色谱峰”（tR=8.647 min）同样峰形对称、分离度良好（图 4-A-a）。为了解释这一现象，对图 4-A-a中保留时间为8.647 min的色谱峰进行了峰纯度测试（图 5），结果发现被测试色谱峰的纯度角（PA=8.754）远大于其纯度阈值（TH=0.605），这表明该色谱峰不是单一成分的色谱峰，而是由2个或2个以上成分完全叠加而成的色谱峰，即米铂脂质体中其他辅料成分严重干扰了米铂的含量测定。经分析研究发现：这一干扰来自于米铂脂质体中的辅料成分-胆固醇。在C8色谱柱上，当流动相中甲醇与水的比例为95：5时，分别取适量米铂对照溶液（图 4-A-b）、胆固醇-甲醇溶液（图 4-A-c）进样，从得到的色谱图看出米铂、胆固醇的保留时间分别为8.567 min、8.633 min，说明在上述色谱条件下，胆固醇与米铂的保留时间相同，两者的色谱峰恰好完全重叠（4-A-a）。
|
1.米铂（miriplatin）2.胆固醇（cholesterol） A.色谱条件：流动相为甲醇-水（95：5）（a.米铂脂质体，b.米铂对照溶液，c.胆固醇-甲醇溶液）[chromatograms of lipomiriplatin（a），free miriplatin（b）and free cholesterol（c）obtained with methanol and water（95：5）as the mobile phase] B.色谱条件：流动相为甲醇-水（92：8）（a.米铂脂质体，b.米铂对照溶液，c.胆固醇-甲醇溶液）[chromatograms of lipomiriplatin（a），free miriplatin（b）and free cholesterol（c）obtained with methanol and water（92：8）as the mobile phase] 图 4 不同流动相比例下的高效液相色谱图 Figure 4 Typical chromatograms with different ratio of the mobile phase |
|
图 5 峰纯度测试图 Figure 5 Peak purity test result |
为了实现米铂与胆固醇的完全分离，尝试调整流动相中甲醇与水的比例，经过一系列尝试最终发现当甲醇与水的比例为92：8时，米铂与胆固醇的色谱峰能够完全分离，分离度为2.91（图 4-B）。至此，排除了胆固醇对米铂含量测定的干扰。最终确定利用C8色谱柱进行米铂脂质体的检测分析，确定的流动相为甲醇-水（92：8）。
5 结论本研究建立了HPLC法用于米铂脂质体中米铂含量的测定，通过系统的方法学研究与验证，认为：本方法操作简便、专属性好、准确度高，适合于米铂脂质体中米铂含量的测定。本方法对其他米铂纳米制剂的含量测定具有参考价值。
| [1] |
IMAI Y, CHIKAYAMA T, NAKAZAWA M, et al. Usefulness of miriplatin as an anticancer agent for transcatheter arterial chemoembolization in patients with unresectable hepatocellular carcinoma[J]. J Gastroenterol, 2012, 47(2): 179. DOI:10.1007/s00535-011-0475-x |
| [2] |
FUJIYAMA S, SHIBATA J, MAEDA S, et al. Phase Ⅰ clinical study of a novel lipophilic platinum complex (SM-11355) in patients with hepatocellular carcinoma refractory to cisplatin/lipiodol[J]. Br J Cancer, 2003, 89(9): 1614. DOI:10.1038/sj.bjc.6601318 |
| [3] |
OKUSAKA T, OKADA S, NAKANISHI T, et al. Phase Ⅱ trial of intra-arterial chemotherapy using a novel lipophilic platinum derivative (SM-11355) in patients with hepatocellular carcinoma[J]. Invest New Drugs, 2004, 22(2): 169. DOI:10.1023/B:DRUG.0000011793.72775.d1 |
| [4] |
KISHIMOTO S, NOGUCHI T, YAMAOKA T, et al. In vitro release of SM-11355, cis[((1R, 2R)-1, 2-cyclohexanediamine-N, N') bis(myristato)] platinum(Ⅱ) suspended in lipiodol[J]. Biol Pharm Bull, 2000, 23(5): 637. DOI:10.1248/bpb.23.637 |
| [5] |
KISHIMOTO S, MIYAZAWA K, FUKUSHIMA S, et al. In vitro, Antitumor Activity, Intracellular accumulation, and DNA adduct formation of cis -[((1R, 2R)-1, 2-cyclohexanediamine-N, N') bis(myristato)] platinum (Ⅱ) suspended in lipiodol[J]. Jpn J Cancer Res, 2000, 91(1): 99. DOI:10.1111/cas.2000.91.issue-1 |
| [6] |
NGUYEN TT, ØSTERGAARD J, STÜRUP S, et al. Determination of platinum drug release and liposome stability in human plasma by CE-ICP-MS[J]. Int J Pharm, 2013, 449(1-2): 95. DOI:10.1016/j.ijpharm.2013.03.055 |
| [7] |
BELL DN, LIU JJ, TINGLE MD, et al. Specific determination of intact cisplatin and monohydrated cisplatin in human plasma and culture medium ultrafiltrates using HPLC on-line with inductively coupled plasma mass spectrometry[J]. J Chromatogr B, 2006, 837(1-2): 29. DOI:10.1016/j.jchromb.2006.03.063 |
| [8] |
SHAIK AN, ALTOMARE DA, LESKO LJ, et al. Development and validation of a LC-MS/MS assay for quantification of cisplatin in rat plasma and urine[J]. J Chromatogr B, 2017, 1046(5): 243. |
| [9] |
ICH, Validation of Analytical Procedures:Text and Methodology:Q2(R1)[EB/OL].2015[2017-8-8].http://www.ich.org/proceducts/guidelines/quality/artide/qualityguidelines.html
|
| [10] |
MOEIN MM, BEQQALI AE, ABDEL-REHIM M. Bioanalytical method development and validation:Critical concepts and strategies[J]. J Chromatogr B, 2017, 1043(3): 3. |
| [11] |
SHABIR GA, LOUGH WJ, ARAIN SA, et al. Evaluation and application of best practice in analytical method validation[J]. J Liq Chromatogr Relat Technol, 2007, 30(3): 311. DOI:10.1080/10826070601084753 |
| [12] |
TURNER EA, STENSON AC, YAZDANI SK. HPLC-MS/MS method for quantification of paclitaxel from keratin containing samples[J]. J Pharm Biomed Anal, 2017, 139(8): 247. |
| [13] |
PORWAL PK, UPMANYU N. Assessment by HPLC of the degradation behavior of acitretin under hydrolytic, oxidative, photolytic and thermal stress conditions[J]. Acta Pharm Sin B, 2014, 4(6): 438. DOI:10.1016/j.apsb.2014.08.004 |
| [14] |
BELLUR AE, YAZAR Y, AĞTAŞ Ç, et al. Development and validation of stability indicating HPLC methods for related substances and assay analyses of amoxicillin and potassium clavulanate mixtures[J]. J Pharm Biomed Anal, 2017, 136(5): 1. |
| [15] |
ARAUJO P. Key aspects of analytical method validation and linearity evaluation[J]. J Chromatogr B, 2009, 877(23): 2224. DOI:10.1016/j.jchromb.2008.09.030 |
| [16] |
WANG X, XIE Y, HU X, et al. Qualitative and quantitative analysis of glucosinolates and nucleosides in Radix Isatidis by HPLC and liquid chromatography tandem mass spectrometry[J]. Acta Pharm Sin B, 2013, 3(5): 337. DOI:10.1016/j.apsb.2013.08.002 |