2017, Vol. 37 
在新药的研制开发过程中，确定基准物质的含量是该过程的重要环节。在国外，甘油磷酸胆碱[1-2]（glycerophosphocholine，GPC，化学结构见图 1）作为一种脑缺血型中风、阿尔茨海默式痴呆以及多发性脑梗死性痴呆的药物应用于临床。有报道通过化学鉴别法、薄层色谱法以及红外吸收光谱图建立了GPC的鉴别标准，并建立了测定其含量的HPLC-ELSD法[3]，但样品前期处理复杂，测试步骤较多，耗时较长，定量时需要高纯度物质作对照。
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图 1 GPC的化学结构 Figure 1 Chemical structure of GPC |
定量核磁共振技术[4-9]（quantitative nuclear magnetic resonance，qNMR）集物质鉴别与含量测定于一体，无需自身对照品，且样品制备简单，预处理环节少，便于质控，特别适用于对新药基准物质的含量测定。另外，类似结构的杂质在谱图中很容易被识别，这使得qNMR与其他需要分离目标分析物和所有杂质才能实现定量的分析方法相比显得更加经济有效。国内对于qNMR的研究和应用较晚，中国药典已将该技术作为法定标准收载于附录中[10]。qNMR包括一维谱（1H、19F、13C、15N、31PNMR）以及一些二维谱（J-分辨、1H-1H相关、1H-13C相关、DOSY等）[11-12]。1H谱是最常用的qNMR方法，方法学研究文献也最多，其他一维谱对不同化合物各有其优势。二维核磁共振法对于在一维谱图中信号严重重叠的样品定量分析非常重要。31P qNMR已经被广泛用于评估含磷化合物的纯度，也用于测定短链磷酸酯含量，结果与色谱技术相当并优于红外光谱和X射线衍射技术，甚至有研究者通过qNMR测定已经通过色谱或DSC认证的标准品的纯度时，发现其纯度实际高于供应商的认证结果[13-14]。
本文在没有对照品对照的情况下，采用31P qNMR对GPC99药物中GPC含量进行分析，以期建立核磁共振定量分析GPC的方法。
1 仪器与试药Bruker AvanceⅢ 400 MHz超导核磁共振波谱仪及液体BBO正相观察宽带探头（瑞士，Bruker Biospin公司）。
氘代甲醇（MEOD-d4）（规格0.6 mL，99.8 atom% D），购自Aldrich试剂有限公司；磷酸三苯酯（纯度99.1%），购自Sigma-Aldrich试剂有限公司；三类新药GPC99，由苏州富士莱医药股份有限公司提供。
2 方法 2.1 供试溶液配制准确称量待测样品约4~22 mg的GPC药物和约6.5 mg的TPP于2 mL EP管中，加入MEOD-d40.6 mL，超声（35 kHz）10 min使其完全溶解，再转移适量至5mm的核磁管中备用。
2.2 仪器参数设置31P观察频率为161.98 MHz，谱宽为64 102.56 Hz，31P 90°脉冲宽度为9.8 μs，采样时间为0.999 944 4 s，弛豫延迟时间为20 s，采样次数为32次，31P化学位移以TPP的信号（δ-17.0）为标准设定，探头温度298 K。
在上述实验条件下采集信号，进行相位调整和基线校正后，测定GPC和TPP定量峰面积的相对比值，采用公式（1）计算GPC的含量：
| $ {\mathit{P}_{\rm{G}}} = \frac{{{\mathit{m}_{\rm{T}}}}}{{{\mathit{m}_{\rm{G}}}}} \times \frac{{{\mathit{A}_{\rm{G}}}}}{{{\mathit{A}_{\rm{T}}}}} \times \frac{{{\mathit{M}_{\rm{G}}}}}{{{\mathit{M}_{\rm{T}}}}} \times {\mathit{P}_{\rm{T}}} \times 100 $ | (1) |
式中PG待测为待测样品纯度（%）；m为质量（g）；M为摩尔质量；A为定量共振峰面积；PT为内标纯度。实验结果精确至0.1%（按质量分数计）。
2.3 HPLC-MS外标法测定色谱分析条件：AcclaimTM Trinity Q1 LC Columns（2.1 mm×50 mm，3 μm），乙腈-水（10 mmol·L-1乙酸铵）（85：15），流速0.4 mL·min-1，进样量：1μL。
质谱分析条件：正离子模式，喷雾电压：4 kV，毛细管温度：350 ℃，SIM模式m/z 258。
3 结果与讨论 3.1 内标及定量峰的选择选择定量峰时，尽量选择峰形较好，周围没有干扰的峰作为定量峰，同时，应对待测物及内标物的谱图进行归属，并明确每个峰对应的原子个数。内标物定量峰与所测样品的定量峰分离良好，不产生干扰。图 2为加入内标物TPP的GPC的定量核磁31P谱，δ0.56的五重峰、δ-17.0的单峰分别为GPC的磷原子及TPP磷原子的峰，由核磁共振谱图可知，两组峰完全解离，互不干扰，因此TPP可以用作内标物。
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图 2 加入内标物TPP的GPC的定量核磁31P谱 Figure 2 31P qNMR spectrum of GPC mixed with internal reference TPP |
选择溶剂时要考虑对待测样品有较好的溶解性，同时要兼顾内标物质的溶解性。氘代溶剂的溶剂峰与待测物及内标物的吸收峰不产生干扰。GPC能溶解于水和甲醇、二甲亚砜等有机溶剂，TPP溶于醇、氯仿等有机溶剂。本研究针对核磁常用溶剂MEOD-d4进行实验，GPC与TPP在MEOD-d4中都能溶解，且溶剂中没有磷元素，对定量峰无干扰，因此本文选择MEOD-d4做溶剂。
3.3 仪器参数的选择弛豫延迟时间、激发脉冲角度的选择是影响定量结果的主要仪器参数，合适的弛豫时间才能保证定量峰积分面积的准确[15]。而选择的激发脉冲角度越小，需要的弛豫延迟时间越短。本文经过实验比较，选用激发脉冲角度为30°，弛豫延迟时间为20 s，对GPC和TPP的定值峰进行准确的积分，满足精度的要求。扫描的具体次数自己选择，要保证基线的平直和高的信噪比。本文统一选定32次。
3.4 线性关系按“2.1”试验方法制备6个待测样品，进行31P qNMR分析得到定量峰和内标峰的峰面积，结果见表 1。
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表 1 样品与内标物的质量及峰面积 Table 1 The mass and integration of thesample and internal reference |
以样品/内标的质量比为横坐标（X），NMR峰面积比为纵坐标（Y），得到的零截距标准曲线为：
| $ \mathit{Y}{\rm{ = 1}}{\rm{.226}}\mathit{X}\;\;\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.996}}\;{\rm{7}} $ |
结果表明，用31P核磁共振定量法对GPC进行定量分析，线性关系良好，是可行的。
3.5 重复性试验取1号样品，在同一条件下连续做6个31P谱，以GPC与TPP的峰面积比检测重复性，RSD为0.274%。
3.6 GPC99药品中GPC的含量本文待测药品GPC99中GPC含量经31P qNMR测定为99.67%。进一步采用HPLC-MS外标法定量分析对核磁共振分析结果进行验证，分析所得GPC99中GPC含量为94.57%，提示在无基准物质的情况下，31P qNMR方法更准确。
4 结论本文建立了对三类新药甘油磷酸胆碱中甘油磷酸胆碱含量的31P核磁共振定量法，该方法简便快捷、准确可靠。
由于核磁共振定量分析是以结构分析为基础的分析方法，结构（包括构型和构象）分析、定性分析、定量分析可同步完成，方法自身具有简单、准确、专一性高和不破坏样品等优点，定量重复性明显优于其他仪器分析方法。绝对定量模式不需要标准品，可直接使用一般的基准物质做内标，结果可靠。若样品中辅料较多，只要不干扰内标和待测组分用于定量的核磁峰，仍然可用该法定量。并且核磁样品制备简单、快速，预处理环节少，便于质控，物质鉴定和定量分析可以同步完成，适用于甘油磷酸胆碱含量的测定，也可为后续研究核磁共振定量分析其它药物提供参考。
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