2017, Vol. 37 
2. 山西师范大学现代文理学院, 临汾 041000
2. Modern College of Arts and Sciences, Shanxi Normal University, Linfen 041000, China
随着顺铂抗癌活性的发现，铂（Ⅱ）和铂（Ⅳ）代的铂类化合物引起人们极大的关注[1]。奥沙利铂（oxaliplatin，L-OHP，如图 1）主要用于治疗晚期大肠癌，是第三代铂类抗癌化合物，相比第一代顺铂和第二代卡铂其毒副作用小[2]。且奥沙利铂与氟尿嘧啶和亚叶酸钙（fluorouracil-leucovorin，FOLFOX）的共同使用能提高晚期结肠癌患者的治愈率[3]。测定生物和药物样品中的奥沙利铂的主要方法包括：高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）[4]、电感耦合等离子体质谱法（inductively coupled plasma mass spectrometry，ICP-MS）[5]、毛细管电泳法（capillary electrophoresis，CE）[6]。然而，毛细管电泳法灵敏度较差，高效液相色谱法仪器设备昂贵，样品处理复杂，电感耦合等离子体质谱法过程复杂比较费时。因此，建立一种简单、快速、灵敏的测定奥沙利铂的方法尤为重要。荧光分光光度法因灵敏度高操作简便等特性，在无机物、有机物和生物样品的测定中得到了广泛的应用[7]。用荧光光谱法测定奥沙利铂未见文献报道。
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图 1 葫芦[7]脲（CB[7]）、巴马汀（PAL）、奥沙利铂（L-OHP）的结构 Figure 1 The structures of cucurbit[7]uril (CB[7]), palmatine (PAL), oxaliplatin (L-OHP) |
葫芦[n]脲（cucurbit[n]uril，CB [n]，n=5、6、7、8、10）是由n个甘脲单元和2n个亚甲基单元桥联起来的大环笼状化合物，具有疏水空腔和羰基氧环绕的端口[8]。端口羰基成为较好的阳离子键合位点，结合其疏水空腔和刚性的结构特点使其具有良好的分子包合和识别性能[9]。葫芦脲对药物分子的包合，可以改变其化学稳定性和热稳定性[10-11]，改善药物的溶解性[12]，控释药物[13]等。葫芦[7]脲（cucurbit[7]uril，CB[7]，如图 1）因具有良好的水溶性，与药物分子形成的包合物稳定性好，近些年受到广泛的关注。葫芦[7]脲与巴马汀可以形成稳定的包合物，且形成的包合物荧光强度显著增强[14]，这为我们用巴马汀作为荧光探针测定抗癌药物奥沙利铂提供了实验依据。
在本文中，建立了一种荧光光谱法测定奥沙利铂（L-OHP）的新方法。这种方法是以奥沙利铂和巴马汀（palmatine，PAL，如图 1）荧光探针对葫芦[7]脲（CB[7]）空腔竞争为基础，用荧光分光光度法检测奥沙利铂。葫芦[7]脲、巴马汀、奥沙利铂在水溶液中均没有荧光，而葫芦[7]脲和巴马汀的包合物在水溶液中具有较强的荧光，在此体系中加入奥沙利铂则荧光显著猝灭。结果表明奥沙利铂在0.05~1.75μg·mL-1的浓度范围内与荧光猝灭值（ΔF）呈良好的线性关系，检出限达到6 ng·mL-1，具有较高的灵敏度，高于以前文献报道的方法1个或几个数量级。本文还通过核磁共振和理论计算探讨了该荧光探针法的作用机理。
1 实验部分 1.1 仪器和试剂Agilent Cary Eclipse型荧光分光光度计（美国安捷伦科技有限公司）；pH S-3C（上海天达仪器有限公司）；核磁共振氢谱在DRX-600MHz型核磁共振波谱仪（瑞士布鲁克公司）。
巴马汀（中国食品药品检定研究院）和葫芦[7]脲储备液的浓度为0.9×10-4 mol L-1；奥沙利铂（中国食品药品检定研究院）配制成50 μg·mL-1标准储备液；氟尿嘧啶（天津金耀药业有限公司）和亚叶酸钙（重庆药友制药有限责任公司）配制储备液的浓度分别为250 μg·mL-1、200 μg·mL-1。尿素、乙二醛水溶液、多聚甲醛、丙酮，均为分析纯，购于洛阳化学试剂厂。参考文献[15]合成葫芦[7]脲，合成过程简述如下：将61.5 g尿素、175 mL水与46 ml乙二醛水溶液在80 ℃下反应6 h合成原料甘脲；再取35.6 g甘脲和15.0 g多聚甲醛在100 ℃下反应20 h合成所需要的葫芦[7]脲。整个实验用水为二次蒸馏水。
1.2 实验方法 1.2.1 光谱检测过程在10 mL比色管中加入0.9 mL 0.9×10-4 mol·L-1的CB[7]和0.9 mL 0.9×10-4 mol·L-1的PAL溶液，随后加入适量的L-OHP溶液。用二次蒸馏水定容到刻度，在室温下摇动15 min。在激发和发射波长为344 nm，496 nm下测定溶液的荧光强度（FPAL-CB[7]-drug），在相同条件下测定空白溶液的荧光强度（FPAL-CB[7]），获得荧光猝灭值（ΔF=FPAL-CB[7]-FPAL-CB[7]-drug）。
1.2.2 人体血样分析在一系列的离心管中分别移取2 mL的血浆样品。再将0.1 mL的奥沙利铂的标准溶液和一定量的氟尿嘧啶、亚叶酸钙加到每个离心管中，震荡3 min，随后加入6 mL甲醇混合均匀，在离心机上6 000r·min-1离心10 min，去除血浆蛋白。随后，用一般荧光光谱测量步骤测定上清液。
2 讨论 2.1 光谱特性在水溶液中，PAL和L-OHP都没有荧光。将L-OHP加入到CB[7]溶液中也没有发现明显的变化。然而，当PAL添加到CB[7]溶液中就观察到荧光强度显著增加，再把L-OHP加到CB[7]/PAL包合体系中荧光显著猝灭（如图 2），这表明可用荧光方法检测抗癌药物L-OHP。
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图 2 在激发波长344 nm下不同标记溶液（pH=7）的荧光光谱 Figure 2 Fluorescence spectra of different marked solutions (pH=7)with excitation wavelengths of 344 nm |
在pH为1~12的范围内研究了其对ΔF的影响。在pH=7.0时加入一定量的L-OHP，荧光猝灭值ΔF最大。考察了10~80 ℃的温度范围内荧光猝灭值ΔF的变化，温度低于35 ℃时荧光猝灭值ΔF基本保持不变，说明包合物稳定存在。温度一旦高于35 ℃时包合物将部分分解，荧光猝灭值ΔF也随之减小。因此，整个实验过程在室温下进行。加入试剂后15 min内ΔF达到最大值，且至少5 h保持不变。因此，实验条件设定为pH 7.0室温下震荡15 min。
2.3 荧光探针机理PAL的水溶液几乎没有荧光，这是由于PAL的异喹啉环通过1个六元环与苯环相连，使得异喹啉环和苯环不在同一平面上，异喹啉环和苯环无法形成共轭体系。但将PAL加到CB[7]水溶液后，PAL的含甲氧基的异喹啉部分进入到CB[7]的疏水空腔，PAL的杂环氮和CB[7]端口羰基氧的静电引力，最终使异喹啉环和苯环形成共轭体系，使得荧光强度大大增强。这不仅使空腔内PAL分子的自由度减少，而且也减少了水溶液可能对荧光猝灭的影响[16]。
当L-OHP加入到CB[7]-PAL体系时，L-OHP分子的进入使得部分PAL分子被挤出。而PAL的光化学特性完全依赖于它所处的微环境，加入L-OHP使PAL失去其在CB[7]疏水空腔的保护，从而导致体系的荧光显著猝灭。竞争识别过程如图 3所示。从结合常数也可以得到论证，由于L-OHP与CB[7]的结合常数KCB[7]-L-OHP为2.3×105 M-1 [17]大于PAL与CB[7]的结合常数KCB[7]-PAL 4.26×104 M-1 [14]，CB[7]与L-OHP具有较强的结合能力，L-OHP将PAL从CB[7]空腔挤出。
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图 3 奥沙利铂与巴马汀对葫芦[7]脲的竞争识别 Figure 3 Competitive recognition of cucurbit[7]uril to oxaliplatin against palmatine |
通过1H NMR证实了CB[7]和L-OHP形成稳定包合物。如图 4所示，客体L-OHP的环己基上质子的峰相对于自由的L-OHP移向高场，这表明环己基环进入了CB[7]的空腔内。同时，CB[7]的峰裂为双重峰，表明两端口周围的环境相对客体L-OHP的封装不再是等效的。这些信号证实了主体与客体以1：1的化学计量比形成稳定包合物。结果与文献报道[18]一致。
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图 4 以D2O为溶剂比较主体CB[7]（a），客体L-OHP（b）和包合物CB[7]-L-OHP（c）的核磁共振氢谱 Figure 4 Comparison of the 1H NMR spectra in D2O of host CB[7] (a), guest L-OHP(b) and inclusion complex CB[7]-L-OHP(c) |
L-OHP和CB[7]相互作用的分子模拟用密度泛函理论[19]在高斯09程序包中进行优化。用6-31G（d）基组优化所有的C、H、O和N原子，用赝式基组Lanl2DZ [20]优化Pt原子。结果表明，CB[7]-L-OHP包合物结构中L-OHP的环己烷进入CB[7]空腔，L-OHP氨基氮原子与CB[7]端口上氧原子在同一平面上且形成氢键，而L-OHP的Pt原子位于这个平面之上（如图 5所示）。结果与文献报道[16]一致。
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颜色代码（color codes）：氧原子用红色（oxygen，red）；碳原子用灰色（carbon，grey）；氮原子用蓝色（nitrogen，blue）；铂原子用黄色（platinum，yellow） 图 5 用球棍模型表示包合物CB[7]-L-OHP的最优结构 Figure 5 Energy-minimized structure of the CB[7]-L-OHP complex in the ground state using sticks and balls for the rendering of atoms |
在最佳实验条件下，将不同浓度的L-OHP加入到CB[7]-PAL体系，荧光光谱如图 6-A所示。线性回归方程：
| $ {\rm{\Delta }}\mathit{F}{\rm{ = 562}}{\rm{.04}}\mathit{C}{\rm{ + 16}}{\rm{.45}}\;\;\;\;\mathit{r}{\rm{ = 0}}{\rm{.999}}\;{\rm{0}} $ |
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A. PAL-CB[7]：a→j：0、0.05、0.15、0.25、0.50、0.75、1.00、1.25、1.50、1.75 B.荧光猝灭值与奥沙利铂浓度的标准曲线（plots of fluorescence quenching values vs. oxaliplatin concentration） 图 6 L-OHP不同浓度（μg mL-1）的荧光光谱 Figure 6 The fluorescence spectra in different concentrations of L-OHP |
在0.05~1.75 μg·mL-1范围内L-OHP浓度和荧光强度ΔF呈现良好的线性关系。最低定量限为20 ng·mL-1，检测限为6 ng·mL-1。该方法比以前报道检测L-OHP方法的灵敏度高，如表 1。灵敏度高于以前文献报道的方法1个或几个数量级。
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表 1 与其他测定L-OHP方法的比较 Table 1 Comparison with other reported methods for the determination of L-OHP |
奥沙利铂、氟尿嘧啶和亚叶酸钙（FOLFOX）的结合使用是化疗转移性或复发性直肠癌的良好处方。将适量的氟尿嘧啶、亚叶酸钙加入到CB[7]-PAL系统，发现探针的荧光强度几乎没有变化。此外，当适量的氟尿嘧啶、亚叶酸钙加入CB[7]-PAL-L-OHP系统，也没有荧光的变化。表明方法具有良好的选择性。
2.5 加标血浆的测定应用于人体加标血浆的测定。数据见表 2，通过对五种浓度的药物加标回收率的评估（每个浓度平行测定5次），回收率达到97.5%~101.4%，表明该探针可用于血浆中L-OHP的测定，有较好的精密度和准确度。
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表 2 L-OHP加标血浆的测定（n=5） Table 2 Determination of L-OHP in spiked plasma |
总之，基于奥沙利铂和巴马汀荧光探针对CB[7]空腔竞争作用，建立了一种奥沙利铂的荧光测定法。本方法简单、快速，灵敏度高，选择性好，可用于血浆中L-OHP的测定。通过荧光光谱、核磁共振、密度泛函理论相互佐证，证实L-OHP与CB[7]可以形成稳定的包合物。这种包合物的形成有助于降低抗癌药物L-OHP的毒性提高药物的疗效，还可以用于其跟踪监测。
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