牛黄为牛科动物牛Bos Taurus domesticus Gmelin的干燥胆结石^[1]，具有清心、豁痰、开窍、凉肝、息风、解毒的作用，是一种常用的名贵中药。随着天然牛黄资源的减少，其代用品体外培育牛黄、人工牛黄应运而生。体外培育牛黄通过在体外模拟牛体内胆结石形成过程，以牛的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸、复合胆红素钙等制成^[1]；人工牛黄则是参照天然牛黄的已知成分，由牛胆粉、胆酸、猪去氧胆酸、牛磺酸、胆红素、胆固醇、微量元素等配制而成^[1]。由于形成过程不同，天然牛黄、体外培育牛黄与人工牛黄，在化学成分和药效方面均存在差别。3种牛黄价格的巨大差异也导致了药材以次充好，中成药中投料混乱的情况出现。文献主要采用高效液相色谱法分析样品中的胆红素和胆酸类成分的有无、含量和比例，对3种牛黄加以鉴别^[2-7]。天然牛黄和体外培育牛黄主要含结合型和共价型胆红素，游离胆红素含量较少。人工牛黄含有的胆红素则以游离型为主，且含量较低；在生产过程中加入了天然牛黄和体外培育牛黄中并不含有的猪去氧胆酸。故可根据胆红素类型和猪去氧胆酸的有无来区分人工牛黄与另外2种牛黄。但天然牛黄和体外培育牛黄成分更为接近，仅在胆红素和胆酸含量的高低和比例方面存在差异，至今仍无确切的判定方法。

与传统的湿化学分析方法不同，近红外光谱（near infrared spectroscopy，NIRS）可以反映样品化学成分全貌，结合模式识别技术可实现研究对象的分类^[8-10]。阳志云等^[11]基于欧式距离建立了人工牛黄的真伪鉴别模型；艾莉等^[12]对人工牛黄正伪品进行聚类分析，结果正品聚为一类，伪品聚为一类，类与类之间有明显的界限；徐路等^[13]提出了基于偏最小二乘回归的类模型方法，将其应用于天然牛黄和人工、掺杂牛黄的分类，训练和预测准确率均为100%；刘姗姗等^[14]采用显微近红外光谱技术结合判别分析法建立了天然牛黄与人工牛黄快速无损的鉴别方法；林培英^[15]、马群等^[16]分别采用偏最小二乘法和支持向量机算法建立了天然牛黄粉中人工牛黄粉掺入量的近红外测定方法。近红外光谱技术应用于体外培育牛黄的质量控制尚未见报道。本文采用近红外漫反射光谱法结合无监督的主成分分析和有监督的判别分析2种模式识别技术，对天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄加以快速、无损鉴别，以期为打击假冒伪劣中药，规范牛黄市场秩序提供技术支持。

1 仪器与试药

Thermo公司Antaris近红外光谱仪，配有积分球附件、Result操作软件与TQ Analyst分析软件。

体外培育牛黄26批，均来自武汉健民大鹏药业有限公司。天然牛黄24批，人工牛黄26批，其中编号为21和75的样品分别为人工牛黄对照药材（批号121197-201204）和天然牛黄对照药材（批号121328-200301），均由中国食品药品检定研究院提供，其余样品收集于北京同仁堂药店、北京同仁堂（亳州）饮片有限责任公司、中国药材公司、四川菲德力制药有限公司、黑龙江多多药业、湖南迪博制药有限公司、甘肃药都集团、大连辉仁制药有限公司、重庆格瑞林药业、百成堂药厂有限公司（香港）等。

2 方法与结果 2.1 光谱采集

取样品粉末，置于内径1 cm的样品管内，加样高度约0.5 cm，样品管敞口放于干燥器中过夜，取出，密塞，采用积分球附件测量近红外漫反射光谱。以仪器内置背景为参比，光谱范围4 000~10 000 cm^-1，扫描次数64次，分辨率8 cm^-1。光谱数据取3次采样的平均值。

2.2 光谱直观比较

天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄的近红外原始光谱见图 1~3，相同种类不同来源或批次的样品，光谱基本一致。比较后可发现，天然牛黄和体外培育牛黄光谱整体面貌更加相似，两者在6 250 cm^-1附近均有一明显的吸收峰，而人工牛黄在4 700 cm^-1附近有一驼峰状吸收峰。仔细比较体外培育牛黄和天然牛黄的光谱差异，在7 050 cm^-1处，前者的吸收峰更加尖锐（见图 4）。

2.3 主成分分析

为更客观地反映不同样品的差异，引入模式识别技术，通过对近红外光谱法进行信息提取和数据分析，实现对研究对象的分类。首先采用主成分分析法。主成分分析（principal component analysis，PCA）是一种无监督的模式识别算法，不需要依据已知类别关系的指导，仅依据样本光谱图的差异进行分类，在不丢失主要光谱信息的前提下选择为数较少的新变量来代替原来较多的变量，消除大量重叠的冗余信息，最大限度地保留有效数据。对3类牛黄样品的近红外原始光谱进行主成分分析，由图 5可见，前10个主成分累积贡献率为99.6%，即前10个主成分可表征原变量99.6%的信息。采用前3个主成分绘制得分图，观察各类样本在主成分空间的分布情况（见图 6）。天然牛黄、体外培育牛黄和人工牛黄样品都可以单独地聚为一类，且互不交叉，根据样品光谱在主成分空间的分布可以对其进行准确归类。3类样品中，体外培育牛黄为独家生产品种，故其分布最为集中。

2.4 判别分析

为进一步精确建立不同种类牛黄的分类识别模型，在主成分分析的基础上，对光谱进行判别分析，提供量化指标用于判断。判别分析（discriminant analysis，DA）是一种有监督的模式识别算法，其基本思想是根据已知样品集特征，选定适合的判别准则，建立定性分析模型，最后用于预测未知样品。本文采用主成分分析-马氏距离法进行判别分析，首先通过主成分分析将数据降维，尽可能多地表征原变量的数据特征而不丢失信息，用其结果来确定未知样品的得分值，得分图用来计算样品到每个类别的马氏距离，距离的值越接近于0，该样品与标准光谱越相似。实际分析中，当标准光谱不止一类，未知样品判为马氏距离最短的那一类。

在3类牛黄样品中各随机选取6批样品组成验证集，其余作为校正集。校正集用于建立判别模型，验证集用于预测模型的性能。近红外光谱谱峰重叠严重，除样品信息外，还含有无用信息、噪声和基线漂移。因此在建立判别分析模型前，需要对光谱的前处理方式进行优化，以便有效提取特征信息，减少噪声及基线漂移的影响，提高模型预测的准确性。以校正集和验证集误判数和性能指数为指标，组合比较了多重散射校正（multiplicative scatter correction，MSC）、正交信号校正（standard normal variate correction，SNV）、一阶求导（1^st D）、二阶求导（2^nd D）、Norris平滑和S-G平滑对模型效果的影响。误判数越低，性能指数越接近100%，模型预测性能越好。由表 1可见，除2^nd D +S-G平滑造成误判外，其余光谱预处理方式误判率均为0，光谱不经处理，模型性能指数最高。最终采用不经处理的全范围（4 000~10 000 cm^-1）光谱，选择主成分为10，建立判别分析模型。结果校正集和验证集误判数均为0，所有样品均得到了正确的分类，模型准确率为100%，见表 2。

3 结论

采用近红外光谱法结合模式识别技术鉴别天然牛黄及其代用品体外培育牛黄和人工牛黄。直观比较发现3类牛黄光谱存在差异；对光谱加以主成分分析，3类样品各自聚为一类；进一步建立了判别分析模型，所有样品预测类别与实际类别一致。近红外光谱技术可以排除人为主观因素的影响，不破坏样品，不消耗化学试剂，不污染环境，尤其适用于牛黄这类贵细中药的分析。模式识别技术的引入将传统感官指标数字化，具有简便、快速、准确、客观的优点。

3类牛黄样品，尤其是天然牛黄，来源稀有，价格昂贵，故用于建立模型的样品数量有限，有待于今后在实践中逐步积累，完善数据库，不断增强模型的代表性和适用性。