2017, Vol. 37 
2. 广州中医药大学第一附属医院, 广州市慢性心力衰竭中医药防治重点实验室, 广州 510405
2. The First Affiliated Hospital of Guangzhou University of Chinese Medicine, Guangzhou Key Laboratory of Chinese Medicine Prevention and Treatment of Chronic Heart Failure, Guangzhou 510405, China
毛冬青药材是冬青科（Aquifoliaceae）冬青属植物毛冬青（Ilex pubescens Hook. et Arn.）的干燥根，是我国南方常用中药，具有活血通脉、消肿止痛、清热解毒等功效，在冠心病、心绞痛和脉管炎等疾病治疗方面应用广泛[1]。毛冬青含有黄酮、香豆素、萜类、甾醇、糖、氨基酸及酚类等多种化学成分。其中三萜皂苷类被认为是毛冬青中的主要活性成分，有关毛冬青化学成分、活性作用及含量测定等的研究大多集中在皂苷类成分。近年来，已有文献报道了应用HPLC-DAD[9]、HPLC-ELSD[2-3]、HPLC-MS[4-5]等法建立毛冬青中皂苷类等成分的含量测定方法。
笔者的前期研究及文献研究发现，毛冬青根中还含有绿原酸类活性成分，绿原酸类成分具有抗炎[6]、抑制血管紧张素转化酶[7]、降血脂[8]等多种重要活性作用，因此，也可能是毛冬青药材治疗心血管疾病的重要物质基础，但针对毛冬青药材中绿原酸类成分的含量测定尚未见报道。本文旨在建立同时测定毛冬青根中4个绿原酸类成分绿原酸，异绿原酸A、B、C，4个皂苷类成分毛冬青皂苷A1、B1、B2，冬青素A等含量的方法，为进一步完善毛冬青根的质量评价提供依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Shimadzu Prominence UFLC二元高压色谱系统，包括LC-20AD XR并联泵、DGU-20A3脱气机、SIL-20AC XR自动进样器、SPD-M20A DAD检测器、CBM-20A处理器、LCMS-Solution version 3.8色谱工作站（岛津公司）；Inertsil ODS-4 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶柱；岛津公司）；Shimadzu AUW120D十万分之一分析天平（岛津公司），HR-02多功能粉碎机（上海哈瑞斯电器有限公司）。
1.2 试剂对照品绿原酸，异绿原酸A、B、C购自成都曼斯特生物科技有限公司，毛冬青皂苷B1和B2购自成都普菲德生物技术有限公司，毛冬青皂苷A1，冬青素A购自上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于98%。毛冬青药材购自广州至信药业有限公司，经深圳大学贺震旦教授鉴定为冬青科植物毛冬青Ilex pubescens Hook. et Arn.的干燥根。乙腈为色谱纯，水为超纯水，磷酸为优级纯，其余试剂均为分析纯。
2 实验方法 2.1 溶液的制备 2.1.1 混合对照品储备液精密称定各对照品适量，加入甲醇配制成含绿原酸12.5 μg·mL-1，异绿原酸B 29.6 μg·mL-1，异绿原酸A 30.0 μg·mL-1，异绿原酸C 34.5 μg·mL-1，毛冬青皂苷B1 169.5 μg·mL-1，毛冬青皂苷B2 130.5 μg·mL-1，毛冬青皂苷A1 324.0 μg·mL-1，冬青素A 728.0 μg·mL-1的混合溶液，即得。
2.1.2 供试品溶液精密称取毛冬青根干燥粉末（过80目筛）0.20 g，加入80%甲醇水4.00 mL，精密称定，室温下超声（250 W，40 kHz）提取30 min，擦干管壁，再次精密称量，以80%甲醇水补充减失的量并混匀，以0.22 μm滤膜滤过，取续滤液即得。
2.2 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-4 C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：0.1%磷酸乙腈为流动相A，0.1%磷酸水为流动相B，梯度洗脱，洗脱程序见表 1；流速：1.0 mL·min-1；检测波长：327 nm（绿原酸，异绿原酸A、B、C），210 nm（毛冬青皂苷B1、B2、A1，冬青素A）；柱温：30 ℃；进样量：5 μL。在上述色谱条件下，对照品及样品色谱图见图 1。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
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1.绿原酸（chlorogenic acid）2.异绿原酸B（isochlorogenic acid B）3.异绿原酸A（isochlorogenic acid A）4.异绿原酸C（isochlorogenic acid C）5.毛冬青皂苷B2（ilexsaponin B2）6.毛冬青皂苷A1（ilexsaponin A1）7.毛冬青皂苷B1（ilexsaponin B1）8.冬青素A（ilexgenin A） 图 1 混合对照品（A）及毛冬青根样品（B）的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances(A) and sample of Radix Ilicis Pubescentis(B) |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备液1、2、4、6、8、10 mL，分别置于10 mL量瓶中，用甲醇定容，在“2.2”项色谱条件下进样测定。以峰面积（Y）为纵坐标，进样浓度（X）为横坐标，进行回归分析，结果表明在一定的质量浓度范围内，与相应的峰面积呈良好线性关系，分别得到回归方程。混合对照品溶液逐级稀释，按上述色谱条件进样测定，定量限为S/N=10时化合物的相应浓度，检测限为S/N=3时化合物的相应浓度。结果见表 2。
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表 2 回归方程、相关系数（r）、线性范围、检测限和定量限 Table 2 Regression equation, correlation coefficient(r), linear range, LOD and LOQ |
精密吸取“2.1.1”项下混合对照品储备溶液，按照上述色谱条件，于24 h内连续进样6次，计算峰面积的RSD，结果8个待测成分峰面积的RSD（n=6）在0.19%~2.0%范围内，表明仪器的精密度良好。
3.3 稳定性试验取同一供试品溶液，分别于0、2、4、8、12和24 h在上述色谱条件下注入液相色谱仪，测定各待测成分的峰面积并计算RSD。结果8个待测成分峰面积的RSD（n=6）在0.67%~2.4%范围内，表明供试品溶液在24 h内稳定性良好。
3.4 重复性试验按“2.1.2”项下方法平行制备6份供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样分析，测定各待测成分的峰面积并计算平均含量及RSD。结果显示样品中绿原酸，异绿原酸A、B、C，毛冬青皂苷A1、B1、B2，冬青素A的平均含量分别为0.15、0.32、0.24、0.27、2.47、1.84、1.23、8.84 mg·g-1，RSD分别为2.9%、2.8%、3.3%、2.6%、3.1%、1.3%、2.3%、2.7%，表明方法重复性良好。
3.5 加样回收率试验精密称取已测知含量的毛冬青根样品共9份，每份0.20 g，分别精密加入相应量的对照品，按“2.1.2”项下方法制备供试溶液，在“2.2”项色谱条件下进样，计算各待测成分的加样回收率，结果见表 3。加样回收率均在92%~103%之间，RSD均小于5%，表明本文方法可靠。
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表 3 毛冬青根中8个成分的加样回收率测定结果（n=3） Table 3 Results of recovery tests of the eight analytes |
按“2.1.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.2”项下色谱条件进样测定，外标法计算样品中8个成分的含量。结果见表 4。
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表 4 3批毛冬青药材的测定结果（mg·g-1，n=3） Table 4 Contents of the eight analytes in different Radix Ilicis Pubescentis samples |
考察了加热回流法、超声提取法对毛冬青根中绿原酸类及皂苷类成分含量测定的影响，结果表明超声波提取法提取的样品成分较多，色谱图峰面积较大，峰形较好，杂质较少，故选择超声波提取法。
5.2 检测波长的选择考察了210、254、327 nm波长下的色谱图，发现在327 nm波长下测定毛冬青根中绿原酸类成分杂质干扰少，灵敏度较高，因此选择327 nm作为绿原酸类化合物的检测波长。而皂苷类化合物多为末端吸收，因此选择了210 nm作为毛冬青根中皂苷类化合物的检测波长。
5.3 流动相的选择考察了甲醇-水、乙腈-水、乙腈-磷酸水溶液等不同流动相体系，结果表明，乙腈-0.1%磷酸水溶液梯度洗脱的色谱峰峰形好，保留时间适中，且基线平稳，可达到理想的分离效果。添加0.1%磷酸可以使峰形改善，减少拖尾，故采用乙腈-0.1%磷酸水溶液作为流动相体系。
5.4 小结文献研究表明，针对毛冬青药材的含量测定研究多集中在对皂苷类成分的测定[9-11]，尚未见建立该药材中同时测定绿原酸类及皂苷类成分含量的报道。绿原酸类成分具有广泛的生物活性，如抗炎[12]、抗氧化[13]、抗自由基，并对心脑血管系统具有良好的保护作用[14-15]，是毛冬青药材治疗疾病的重要物质基础。笔者采用高效液相色谱法，同时测定毛冬青根中4个绿原酸类成分和4个皂苷类成分的含量，所测成分色谱峰分离度良好，方法简便快速，结果准确可靠，并具有重现性好、灵敏度高等特点，应用该方法可更全面地控制毛冬青药材的质量。
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