2017, Vol. 37 
2. 吉林省安图县安图林业有限公司, 安图 133600
2. Jilin Prorincial Antu Forestry Co. Ltd., Antu 133600, China
紫苏为我国国家食品药品监督管理局规定的既是食品又是药品的一种草本植物，营养丰富，在全国各地均有栽培，被广泛用于食品和医药领域。紫苏叶和紫苏子是常见的蔬菜、香料和油料作物；同时，具有解表散寒、行气和胃功效的紫苏叶和具有降气化痰、止咳平喘、润肠通便功效的紫苏子，又是中国药典收载的常用中药[1]。紫苏子和紫苏叶富含丰富的营养成分，如黄酮类化合物、类胡萝卜素类、迷迭香酸、油脂、氨基酸、蛋白质、维生素及矿物质等[2-5]，实验证明具有增强免疫力、抗氧化、抗衰老、抗肿瘤、抗菌、降血脂、预防和治疗心脑血管疾病等多种生物活性[6-9]。众所周知，氨基酸和蛋白质是生物体构造中重要的生物活性分子，也是维持生命活动的物质基础。目前，氨基酸含量的检测方法很多，氨基酸测定仪最常用，而高效液相色谱法由于其操作简单，结果准确，被广泛应用于各类成分分析，且高效液相色谱法检测氨基酸类成分较氨基酸分析仪灵敏度高。有关紫苏的氨基酸成分分析，多采用氨基酸自动分析仪检测[10-12]，仅见蔡乾荣等[13]采用HPLC法分析27种不同产地紫苏属植物叶片中氨基酸组成及含量。本研究分别以吉林产紫苏子和紫苏叶为实验材料，采用HPLC法结合柱前衍生化法检测其中氨基酸的种类和含量，以期为紫苏在食品、保健食品，以及药品的深入开发利用提供依据。
1 仪器与试药 1.1 仪器Agilent 1260高效液相色谱仪（安捷伦科技有限公司）；Ultimate Amino Acid氨基酸色谱专用柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：超高纯全多孔球形硅胶；安捷伦科技有限公司）；KH-300DB型数控超声波清洗器（昆山市超声仪有限公司）；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵（郑州长城科工贸有限公司）；HH4数显恒温水浴锅（金坛市江南仪器厂）；BS210S万分之一天平（SARTORIUS科学仪器有限公司）。
1.2 试药紫苏叶和紫苏子购于吉林大药房（20150612），产地吉林省，经吉林农业大学张连学教授鉴定分别为唇形科植物紫苏Perilla frutescens（L.）Britt.的干燥叶和干燥成熟果实。
21种氨基酸对照品[天冬氨酸（Asp，批号B21934）、谷氨酸（Glu，批号B21916）、天冬酰胺（Asn，批号B21935）、丝氨酸（Ser，批号B21932）、谷氨酰胺（Gln，批号B21917）、甘氨酸（Gly，批号YY91068）、组氨酸（His，批号B21938）、精氨酸（Arg，批号B21920）、苏氨酸（Thr，批号B21933）、丙氨酸（Ala，批号B21911）、脯氨酸（Pro，批号YY91067）、半胱氨酸（Cys，批号B21909）、酪氨酸（Tyr，批号B21924）、缬氨酸（Val，批号B21936）、蛋氨酸（Met，批号B21913）、胱氨酸（L-Cys，批号YY91072）、异亮氨酸（Ile，批号YY91218）、亮氨酸（Leu，批号B21925）、苯丙氨酸（Phe，批号YY91012）、色氨酸（Trp，批号B21930）、赖氨酸（Lys，批号B21922）]，纯度均大于98%，购于上海源叶生物科技有限公司；三乙胺、异硫氰酸苯酯、浓盐酸为分析纯，正己烷和乙腈为色谱纯，水为娃哈哈纯净水。
2 色谱条件采用Ultimate Amino Acid氨基酸色谱专用柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），柱温35 ℃，流动相A为乙腈-水（80：20），流动相B为醋酸钠缓冲溶液（pH 6.5）-乙腈（93：7）[12]，梯度洗脱（0 min，0%A；7 min，3.5%A；10 min，4.0%A；15 min，6.5%A；18 min，11.0%A；22 min，13.4%A；34 min，30%A；37 min，68%A；42 min，100%A；49 min，100%A；52 min，0%A），流速1.0 mL·min-1，检测波长254 nm。
3 溶液的制备 3.1 衍生试剂的制备衍生试剂A：取三乙胺1.4 mL，加乙腈8.6 mL，混匀，4 ℃保存；衍生试剂B：取异硫氰酸苯酯100 μL，加乙腈8 mL，混匀，4 ℃保存[14]。
3.2 混合对照品溶液的制备与衍生化精密称定21种氨基酸适量，加0.1 mol·L-1盐酸超声溶解，配制成天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸质量浓度分别为3.25、3.11、3.24 mmol·L-1，其他氨基酸浓度均为2.5 mmol·L-1的混合对照品溶液，4 ℃保存。
精确吸取混合对照品溶液400 μL，置于5 mL离心管中，加入衍生试剂A和B各200 μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷800 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45 μm滤膜滤过，即得。取6 μL进行色谱分析。
3.3 供试品溶液的制备与衍生化 3.3.1 用于游离氨基酸测定取紫苏子和紫苏叶样品各2.0 g，精密称定，加入50%乙醇溶液200 mL，超声（300 W，100 kHz）提取2次，每次30 min，合并滤液，滤液于80 ℃水浴挥至近干，用纯净水定容至10 mL，即得供试品溶液。取供试品溶液1 mL，置于5 mL离心管中，加入衍生试剂A 100 μL，衍生试剂B 100 μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷400 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45 μm滤膜滤过，取6 μL进行色谱分析。
3.3.2 用于总氨基酸测定取紫苏子和紫苏叶样品各1.0 g，精密称定，分别加入6 mol·L-1盐酸水溶液10 mL、1%的苯酚1 mL，抽真空充氮气，重复3次，于110 ℃烘箱中水解24 h，过滤得水解液，水解液于80 ℃水浴挥干，加入2 mL的纯净水超声溶解，并用3 mol·L-1氢氧化钠溶液调节溶液pH近中性，最后紫苏子样品用纯净水定容至10 mL，紫苏叶样品用纯净水定容至15 mL，即得紫苏子和紫苏叶的供试品溶液。分别吸取紫苏子和紫苏叶的供试品溶液各1 mL，置于5 mL离心管中，加入衍生试剂A 100 μL，衍生试剂B 100 μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷400 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45 μm滤膜滤过，取6 μL进行色谱分析。
3.3.3 空白溶液的制备与衍生化精确吸取0.1 mol·L-1盐酸溶液400 μL，置于5 mL离心管中，加入衍生试剂A和B各200 μL，摇匀，静置1 h，加入正己烷800 μL，振摇后放置10 min，取下层溶液，0.45 μm滤膜滤过，取6 μL进行色谱分析。
4 线性关系考察分别将“3.2”项下的混合对照品溶液浓度稀释为原来的3/4、1/2、1/4、1/8、1/20、1/50、1/100、1/500，得到不同浓度的系列混合对照品溶液，按“3.2”项下操作方法进行衍生化，精密吸取6 μL进行色谱分析。以各氨基酸峰面积积分值Y为纵坐标，浓度X（mmol·L-1）为横坐标，进行线性回归，可得天冬氨酸、谷氨酸和半胱氨酸的检测浓度分别在0.006 5~ 3.2、0.006 2~3.1、0.006 5~3.2 mmol·L-1范围内，其余18种氨基酸的检测浓度在0.005 0~2.5 mmol·L-1范围内，与各自峰面积积分值呈良好的线性关系。21种氨基酸的线性回归方程及相关系数（R2）见表 1。
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表 1 21种氨基酸的线性回归方程及相关系数 Table 1 Linear regression equation and correlation coefficient of 21 amino acids |
取“3.2”项下的混合氨基酸对照品溶液400 μL，按“3.2”项下方法衍生后连续进样6次，测定峰面积。结果21种氨基酸峰面积的RSD（n=6）在0.26%~1.9%之间，表明仪器精密度良好。
5.2 稳定性试验取“3.3”项下紫苏子和紫苏叶供试品溶液各1 mL，衍生后分别于0、2、4、8、12、24 h进样，测定峰面积。结果紫苏子中21种氨基酸峰面积的RSD（n=6）为0.48%~2.0%；紫苏叶中21种氨基酸峰面积的RSD（n=6）为0.56%~2.1%，表明紫苏子和紫苏叶供试品溶液衍生化后在24 h内比较稳定。
5.3 重复性试验分别取同一批紫苏子和紫苏叶各6份，分别按“3.3.1”和“3.3.2”项下方法制备用于测定游离氨基酸和用于测定总氨基酸的紫苏子和紫苏叶的供试品溶液并衍生后，按“2”项下色谱条件进样测定峰面积，计算氨基酸含量。结果紫苏子中21种游离氨基酸百分含量的RSD（n=6）在1.0%~2.3%之间，测定总氨基酸的21种氨基酸百分含量的RSD（n=6）在0.59%~2.5%之间；紫苏叶中21种游离氨基酸百分含量的RSD（n=6）在0.87%~2.2%之间，测定总氨基酸的21种氨基酸百分含量的RSD（n=6）在0.93%~2.3%之间，表明该方法重复性良好。
5.4 紫苏子和紫苏叶总氨基酸加样回收率试验取已测知含量的紫苏子或紫苏叶样品0.5 g共6份，精密称定，分别加入“3.2”项下的混合对照品溶液2 mL，按照“3.3.2”项下总氨基酸检测方法分别提取、衍生、进样，平行6次，计算各氨基酸的回收率。结果紫苏子中21种氨基酸的平均回收率（n=6）在93.21%~101.6%之间，RSD在0.87%~2.9%之间；紫苏叶中21种氨基酸的平均回收率（n=6）在96.88%~100.8%之间，RSD在0.68%~2.7%之间。
6 样品测定结果取3个批次的紫苏子样品和紫苏叶样品，按“3.3”项下方法制备紫苏子和紫苏叶的供试品溶液并衍生化，HPLC检测并计算其中游离氨基酸和总氨基酸含量，结果见表 2，色谱图见图 1。
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表 2 紫苏子和紫苏叶中游离和水解氨基酸的含量测定结果（x±s，μg·g-1） Table 2 Results of the determination of free and hydrolyzed amino acids in Perillae Fructus and Perillae Folium |
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1~21.同表 2（same as Tab. 2） A.氨基酸对照品（amino acid reference substances）B.空白（blank control）C.紫苏子水解氨基酸（hydrolyzed amino acids of Perillae Fructus）D.紫苏叶水解氨基酸（hydrolyzed amino acids of Perillae Folium）E.紫苏子游离氨基酸（free amino acids of Perillae Fructus）F.紫苏叶游离氨基酸（free amino acids of Perillae Folium） 图 1 紫苏子、紫苏叶中水解氨基酸和游离氨基酸的HPLC图 Figure 1 HPLC chromatograms of the free and hydrolyzed amino acids in Perillae Fructus and Perillae Folium |
由表 2可知，紫苏子和紫苏叶中的游离氨基酸含量分别为364.99、2 098.60 μg·g-1；总氨基酸含量分别为26.77、27.82 mg·g-1。紫苏子中检测到17种游离氨基酸，含8种人体必需氨基酸，其中甘氨酸、谷氨酸、苏氨酸和天冬氨酸含量较高，检测到17种水解氨基酸，含7种人体必需氨基酸，其中天冬氨酸、精氨酸和谷氨酸含量较高，与王永奇等检测结果[15]相似；紫苏叶中检测到18种游离氨基酸，含7种人体必需氨基酸，其中组氨酸、天冬氨酸和天冬酰胺含量较高，检测到17种水解氨基酸，含7种人体必需氨基酸，其中天冬氨酸、脯氨酸和谷氨酸含量较高。紫苏子和紫苏叶水解后均未检测到天冬酰胺、半胱氨酸和赖氨酸，可能水解过程中天冬酰胺被脱酰胺基，半胱氨酸和赖氨酸被解离。
7 结论蔡乾荣等[13]采用OPA和FMOC柱前衍生HPLC法检测的27份不同产地紫苏属叶片的氨基酸中以甘氨酸含量最高，其次是亮氨酸和谷氨酸，而本法检测的吉林产紫苏子和紫苏叶中天冬氨酸和谷氨酸含量较高，可能与产地有关。其他学者[10-12]研究报道的采用氨基酸自动分析仪检测紫苏叶中的氨基酸结果与本试验也有差异，可能与紫苏的采收时间、储藏条件等有关。
本研究建立了PITC柱前衍生HPLC法检测紫苏子和紫苏叶中游离氨基酸和水解氨基酸含量的，色谱图显示，21种氨基酸可在梯度洗脱条件下达到基线分离，且方法学考察结果显示，该法简单、准确，重复性好。通过该法检测可知紫苏叶中无论游离氨基酸还是水解氨基酸含量均较紫苏子高。
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