2017, Vol. 37 
2. 广东省药品检验所, 广州 51018
2. Guangdong Institute for Drug Control, Guangzhou 510180, China
沉香化气丸全方由沉香、木香、广藿香、陈皮、醋香附、砂仁、醋莪术、六神曲（炒）、炒麦芽甘草10味药材制成，具有理气疏肝、消积和胃的功效，用于治疗肝胃气滞、脘腹胀痛、食欲不振等症状[1-2]。方中木香、陈皮为君药，起理气、消积和胃的作用。木香中主要含有半萜内酯和三萜类化合物，活性成分以木香烃内酯和去氢木香内酯为主，研究报道，这2个成分均能通过抑制核转录因子（NF-κB）的活化，从而起抗炎的效果[3]；陈皮的主要活性成分是橙皮苷、芸香柚皮苷、柚皮苷，具有较好的抗氧化能力、抗炎、促胃动力作用、抗肿瘤活性[4-7]；广藿香的主要成分包括挥发油和黄酮类成分，广藿香酮为其主要的活性成分之一，具有抗菌、抗炎、抗溃疡等药理作用[8-10]；甘草起解毒调和诸药的作用，其主要活性成分是三萜皂苷和黄酮类成分[11]，代表物质分别为甘草酸和甘草苷。
沉香化气丸化学成分的定量分析，中国药典2015年版采用HPLC法测定橙皮苷的量来控制其质量[1]，有文献采用GC法测定沉香化气丸中乙酸龙脑酯、百秋李醇、去氢木香内酯的含量[12]，其他活性成分未见报道。中药复方所含成分极为复杂，其作用特点是多成分、多靶点、多环节发挥作用，经多途径的整合而发挥疗效，采用单指标的含量测定控制其质量具有一定的片面性。因此，本文建立UPLC梯度洗脱与波长切换法对沉香化气丸中甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯与广藿香酮的含量进行同时测定，为有效控制沉香化气丸的质量提供科学依据。
1 仪器与试药ACQUITY UPLCTM液相色谱仪（Waters公司），包括二元超高压溶剂系统、自动进样器、在线脱气系统、柱温箱、TUV检测器和Empower 2色谱工作站；Phenomenex Kinetex C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Phenomenex公司）。Milli-Q型超纯水仪（Millipore公司）；KQ-300DE型超声波清洗器（昆山超声波仪器有限公司），CP225D型十万分之一电子分析天平（Sartorius公司）。
乙腈为色谱纯，甲醇、磷酸为分析纯，水为超纯水。
对照品甘草苷（质量分数93.7%，批号111610-201106）、橙皮苷（质量分数95.3%，批号110721-201316）、甘草酸铵（质量分数93.1%，批号110731-201418）、木香烃内酯（质量分数99.0%，批号111524-201509）、广藿香酮（质量分数100%，批号111822-201102）均购于中国食品药品检定研究院；对照品芸香柚皮苷（质量分数99.2%，批号MUST-16030408）、柚皮苷（质量分数98.28%，批号MUST-15091804）均购于成都曼思特生物科技有限公司。沉香、木香、广藿香、醋香附、砂仁、陈皮、醋莪术、炒麦芽、六神曲（炒）、甘草，均购于广东省药材公司中药饮片厂，经广东省药品检验所中药室李华主任中药师鉴定，均符合中国药典2015年版规定。
8批沉香化气丸样品，其中3批由实验室按照中国药典2015年版中处方的制法自制（批号分别为20160402、20160403、20160406），其余5批为成都地奥集团天府药业股份有限公司产品（批号分别为151002、151017、151018、151101、151102）。
2 方法与结果 2.1 混合对照品储备液的制备精密称取甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯和广藿香酮的对照品适量，分别置7个量瓶中，加入甲醇配制成每1 mL含上述7个成分依次为331.7、345.7、132.7、240.9、425.4、358.9、181.6 μg的对照品储备液；精密吸取上述各对照品储备液适量，加甲醇制成每1 mL含甘草苷7.32 μg、芸香柚皮苷5.96 μg、柚皮苷2.20 μg、橙皮苷32.88 μg、甘草酸7.32 μg、木香烃内酯8.04 μg、广藿香酮3.92 μg的混合对照品储备液，存放于4 ℃冰箱，备用。
2.2 供试品溶液的制备取沉香化气丸样品，研细，取约0.5 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入甲醇25 mL，称量，超声（功率300 W，频率40 kHz）处理45 min，放冷，再称量，用甲醇补足减失的量，摇匀，滤过，取续滤液，过0.22 μm微孔滤膜，即得。
2.3 阴性样品溶液的制备按照沉香化气丸中的处方比例，制备缺木香、广藿香、陈皮、甘草的阴性样品，按“2.2”项下方法，制备阴性样品溶液。
2.4 色谱条件色谱柱：Phenomenex Kinetex C18（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）；流动相：乙腈（A）-0.1%磷酸水溶液（B），梯度洗脱程序见表 1；流速：0.8 mL·min-1；分段变波长：210 nm（0~20 min，检测甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷）、254 nm（20~25 min，检测甘草酸）、210 nm（25~30.8 min，检测木香烃内酯）、310 nm（30.8~34 min，检测广藿香酮）、210 nm（34~42 min）；进样量：2 μL；柱温：35 ℃。
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表 1 梯度洗脱程序 Table 1 Gradient elution program |
取混合对照品溶液（甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯、广藿香酮浓度分别为13.81、14.68、3.64、47.46、17.86、7.33、5.97 μg·mL-1）、供试品溶液、阴性样品溶液，按“2.4”项色谱条件进样分析，记录色谱图，结果见图 1。甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯和广藿香酮的理论塔板数均大于10 000，其色谱峰与相邻峰的分离度均大于1.5；阴性样品对样品检测无干扰。
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A.混合对照品（mixed reference substances）B.样品（sample）C.缺木香、广藿香、陈皮、甘草的阴性样品（negative sample without Aucklandiae Radix，Pogostemonis Herba，Citri Pericarpium Reticulatae and Glycyrrhizae Radix et Rhizoma）1.甘草苷（liquiritin）2.芸香柚皮苷（narirutin）3.柚皮苷（naringin）4.橙皮苷（hesperidin）5.甘草酸（glycyrrhizinate）6.木香烃内酯（costunolide）7.广藿香酮（pogostone） 图 1 沉香化气丸UPLC色谱图 Figure 1 UPLC chromatograms of Chenxiang Huaqi pills |
精密吸取“2.1”项下甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、甘草酸、木香烃内酯、广藿香酮的对照品储备液均分别为0.05、0.2、0.4、0.6、0.8、1.2 mL，一一对应分别置同一10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，摇匀，制备成6份不同质量浓度的混合对照品溶液；分别精密吸取“2.1”项下的橙皮苷对照品溶液0.2、0.4、0.8、1.0、2.5、5.0 mL，置5 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，制备成6份不同质量浓度的橙皮苷对照品溶液。按“2.4”项色谱条件，分别进样2 μL进行测定，记录峰面积。以对照品质量浓度X（μg·mL-1）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，进行线性回归，得到各成分的回归方程及相关系数。按信噪比（S/N）3:1和10:1分别测定各成分的检测限和定量限，结果见表 1。
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表 1 7个成分的回归方程、相关系数、线性范围、LOD及LOQ Table 1 Linear regression equations, LOD and LOQ of seven components |
精密吸取甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、甘草酸、木香烃内酯、广藿香酮质量浓度为13.27、13.83、5.31、17.01、14.36、7.26 μg·mL-1混合对照品溶液，橙皮苷48.18 μg·mL-1对照品溶液，按“2.4”项下色谱条件连续进样6次测定分析，记录峰面积。结果甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯和广藿香酮峰面积的RSD分别为0.47%、0.61%、0.66%、0.47%、0.48%、0.43%、0.70%，表明仪器精密度良好。
2.8 稳定性试验取同一份供试品溶液（样品批号20160403），分别于室温下放置0、2、4、6、8、12、24 h进样，进行分析。结果不同时间甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯和广藿香酮峰面积的RSD分别为1.4%、0.78%、2.1%、0.50%、1.8%、0.69%、1.6%，表明供试品溶液中7个成分在24 h内稳定。
2.9 重复性试验取同一批样品（批号20160403），按“2.2”项下的方法平行制备6份供试品溶液，按“2.4”项下条件进行测定，测得甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、甘草酸、木香烃内酯和广藿香酮的平均含量（n=6）分别为0.706、0.574、0.204、3.170、0.702、0.738和0.345 mg·g-1，RSD分别为1.5%、2.7%、1.6%、2.9%、1.7%、1.1%和1.6%，表明本法重复性良好。
2.10 加样回收试验精密称取已知含量的样品（批号20160403）约0.25 g，精密称定6份，分别置具塞锥形瓶中，精密加入“2.1”项下混合对照品溶液25 mL，按“2.2”项下方法制备成供试溶液，按“2.4”项色谱条件下进行测定，记录各成分的峰面积，计算加样回收率。结果见表 2。
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表 2 加样回收试验结果（n=6） Table 2 Results of recovery test |
取8批沉香化气丸样品，按“2.2”项下方法制备供试品溶液，按“2.4”项下方法进行测定，按照标准曲线法计算其含量，结果见表 3。因为重复性的时候，批号20160403做了6份，其他批号均测定3份
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表 3 样品含量测定结果（mg·g-1，n≥3） Table 3 Determination results of samples |
由于处方组成复杂且所测定7个成分的紫外吸收情况差异较大，采用PDA检测器扫描7个待测成分吸收峰在200~400 nm波长范围内的紫外吸收图谱，结合7个成分的光谱图，发现甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷、木香烃内酯在210 nm处有较大的吸收；甘草酸在254 nm，广藿香酮在310 nm有较大的吸收且干扰小。因此，本实验采用波长切换技术[13]，将波长设为0~20 min时210 nm（甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷），20~25 min时254 nm（甘草酸），25~30.8 min时210 nm（木香烃内酯）；30.8~34 min时310 nm（广藿香酮）。
3.1.2 流动相的选择本实验考察了乙腈-水、甲醇-水体系，结果发现乙腈的洗脱能力优于甲醇，基线平且灵敏度高，因此选乙腈作为流动相的有机相；因甘草酸具有酸性，加入一定比例的酸可以改善峰形，且可提高待测组分的分离效果。实验考察了在水相中加入甲酸溶液和不同比例的磷酸溶液，由于甲酸水溶液在210 nm低波长处的紫外吸收较大，导致化合物的吸收较低。比较了乙腈-0.1%磷酸水溶液与乙腈-0.5%磷酸水溶液，分离效果无明显差别，因此选用乙腈-0.1%磷酸水溶液为流动相的水相。
3.1.3 色谱柱及柱温的选择实验中考察了3种不同型号的色谱柱：Phenomenex kinetex C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm）、Thermo Accucore C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.6 μm）和Agilent Poroshell C18色谱柱（4.6 mm×100 mm，2.7 μm），结果表明Phenomenex kinetex C18色谱柱的柱效较高，峰形对称，分离效果好，因此选用该色谱柱。实验考察了25、30、35 ℃不同柱温对分离效果的影响，结果表明柱温的改变可以提高分离效果。当柱温较低时，色谱峰展宽，柱压较大，保留时间较长，分离度效果较差；提高柱温时，色谱峰变窄，柱压降低，保留时间提前，分离效果较好，但由于过高的柱温会损害色谱柱的使用寿命，所以本实验选用35 ℃柱温。
3.2 样品提取条件的优化甘草苷、芸香柚皮苷、柚皮苷、橙皮苷属于黄酮苷类成分，极性较大，而木香烃内酯和广藿香酮极性较小。根据各成分的结构和性质，本实验对比了索氏提取法和超声提取法，发现2种提取率相近，考虑木香烃内酯和广藿香酮成分的热不稳定性，且超声简便快捷，故实验选用超声提取的方法。对提取溶剂（乙酸乙酯、甲醇、80%甲醇、50%甲醇、30%甲醇、水、95%乙醇）进行考察，结果表明甲醇对待测成分的提取效果优于乙酸乙酯和95%乙醇提取，50%甲醇提取杂质较多，且不易过滤，水提液中橙皮苷、木香烃内酯和广藿香酮几乎损失85%，因此选择甲醇做为提取溶剂。本实验仅考察了提取时间30、45、60 min，结果表明45 min以上，提取效果无明显差别，故提取时间为45 min。
3.3 小结本实验采用UPLC法建立同时测定沉香化气丸中7个成分含量的方法，在42 min内7个成分获得较好的分离，该方法具有操作简便，分析快速，专属性强等特点，为全面控制沉香化气丸的质量提供了重要参考依据。
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