2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 中国药科大学, 南京 211198
2. China Pharmaceutical University, Nanjing 211198, China
安宫牛黄丸源于清吴鞠通的《温病条辨》，由牛黄或体外培育牛黄、犀角、郁金、麝香或人工麝香、珍珠等11种药味组成，具有清热解毒、豁痰开窍之功效，是临床急重病用药品种，也是中医治疗高热症的“温病三宝”之一，主要用于高热惊厥、脑卒中及昏迷。安宫牛黄丸处方中牛黄为其君药，含有胆汁酸类成分[1-3]，如胆酸、牛磺胆酸、去氧胆酸、甘氨胆酸等。药理学研究结果表明胆汁酸类成分，尤其是胆酸和牛磺胆酸，具有解热、抗炎、抗菌、镇咳等[4]作用，与安宫牛黄丸清热解毒等功效直接相关。由于牛黄价格昂贵且来源稀缺，故本次研究的样品标识为体外培育牛黄的安宫牛黄丸。体外培育牛黄，是以牛科动物牛Bostaurus domesticus Gmelin的新鲜胆汁作母液，加入去氧胆酸、胆酸和复核胆红素等制成[5]，是牛黄的主要代用品之一，药典中收载的功效与牛黄一致，在安宫牛黄丸处方中可与牛黄等同使用[6-7]。目前安宫牛黄丸的质量研究主要集中在黄芩苷、黄芩素、栀子苷、小檗碱，以及总胆红素等成分的研究[8-9]。本文对安宫牛黄丸中胆汁酸类成分进行研究，以牛黄中含量较高的游离胆酸和结合胆酸牛磺胆酸为指标，通过胆酸与牛磺胆酸的比例关系，对安宫牛黄丸的质量进行了初步的探索。
牛黄中胆汁酸类成分，主要以甾体类成分为主，其研究方法主要集中在薄层色谱或高效薄层色谱，液相色谱或超高效液相色谱与蒸发光散射联用，以及液质联用的技术方法[7-11]。基于中药制剂中基质复杂，结构相近的成分较多，干扰较大等缺限，本文采用液质联用结合多反应监测（MRM）的方法对安宫牛黄丸中胆汁酸类成分进行研究，有效去除其他成分的干扰，该方法灵敏度高且专属性好。
1 仪器、试药及样品安捷伦公司Agilent 1260-6410B液相色谱-质谱联用系统，Mass Hunter化学工作站；日本株式会社维美希YMC-Pack ODS-A色谱柱（150 mm×3.0 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；瑞士梅特勒-托利多公司Mettler XS105DU电子天平；昆山市超声仪器有限公司KQ-300DA型数控超声波清洗仪（超声功率300 W，频率40 kHz）。
乙腈为色谱纯，醋酸铵、甲酸为分析纯，试验用水为Milli-Q系统制备。
对照品牛磺胆酸钠（批号110815-200707）、胆酸（批号100078-200414）；以及对照药材水牛角粉（批号121627-201001）、珍珠（批号121022-200403）、黄连（批号120913-201310）、黄芩（批号120955-201309）、栀子（批号120986-201309）、郁金（批号120949-201407）和冰片（批号111688-200501）均由中国食品药品检定研究院提供；雄黄、朱砂由中国食品药品检定研究院中药民族药检定所提供；体外培育牛黄均为武汉健民药业有限公司产品，批号为ZY160401、ZY160402、120901、121101、ZY160403、120601、120501、ZY160404、121001、ZY160405；人工麝香均购于中国药材公司，批号为2015YR020、2015YR012、2015YR015、2015YR010、2015YR051、2015YR013。
安宫牛黄丸均为市售样品，批号为Gzh_byshW02037、Gzh_bysht07155、Gzh_byshv_7078、Jzht_20150501、Jzht_20151107、Jlczh_20150601、Jlczh_20140401。
2 色谱方法 2.1 色谱和质谱条件色谱柱：YMC-Pack ODS-A（150 mm×3.0 mm，5 μm）；流动相：以乙腈-10mmol·L-1醋酸铵的0.2%甲酸溶液（40:60）为流动相；流速：0.4 mL·min-1。
采用电喷雾负离子模式（ESI-），MRM模式进行检测，其中胆酸选择m/z 407.0→289.0，裂解电压195 V，碰撞电压105 V；牛磺胆酸选择m/z 514.0→79.8，裂解电压205 V，碰撞电压45 V。离子源参数：干燥气温度350 ℃，干燥气流速9 L·min-1，雾化气压力241 kPa，源电压3.5 kV。混合对照品、安宫牛黄丸和体外培育牛黄总离子流图见图 1。
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1.牛磺胆酸（taurocholate acid）2.胆酸（cholic acid） 图 1 混合对照品（A）、安宫牛黄丸（B）和体外培育牛黄（C）LC-MS/MS总离子流图 Figure 1 LC-MS/MS total ion chromatograms of mixture standards (A), Angong Niuhuang pills(B) and Bovis Calculus Sativus (C) |
取牛磺胆酸钠对照品、胆酸的对照品各约10 mg，精密称定，分别置25 mL量瓶中，加80%甲醇水溶液至刻度，即得对照品储备液。精密量取上述对照品储备液各2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅰ；分别精密量取混合对照品溶液Ⅰ 0.2 mL，置10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得混合对照品溶液Ⅱ；精密吸取对照品溶液Ⅰ 0.1、0.2、0.5、1.0、2.0 mL，分别置5 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，即得；精密吸取对照品溶液Ⅱ 0.1、0.5、1 mL，分别置10 mL量瓶中，加入甲醇至刻度，摇匀，即得。
2.2.2 供试品溶液取本品1 g，剪碎，混匀，取约0.1 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，精密加入80%甲醇水溶液25 mL，密塞，称量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称量，用80%甲醇水溶液补足减失量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
2.2.3 体外培育牛黄供试品溶液、人工麝香供试品溶液取体外培育牛黄或人工麝香约0.01 g，精密称定，置具塞锥形瓶中，按“2.2.2”项下方法操作，精密加入80%甲醇水溶液25 mL，密塞，称量，超声处理（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，再称量，用80%甲醇水溶液补足减失的量，摇匀，取上清液，滤过，取续滤液，即得。
2.2.4 对照样品溶液按处方和工艺，制成安宫牛黄丸对照样品。按照“2.2.2”项下方法操作，制备对照样品溶液。
2.3 测定法分别精密吸取混合对照品溶液与供试品溶液各5 μL，注入液相色谱-质谱联用仪，测定，即得。
3 方法学验证 3.1 线性范围分别精密吸取上述系列混合对照品溶液5 μL注入液相色谱仪，以进样量X（ng）为横坐标，峰面积Y为纵坐标，求得胆酸、牛磺胆酸回归方程：
Y=96.5X-22.8 r=0.999 5
Y=1 419.6X + 994.5 r=0.999 0
结果表明胆酸进样量在0.91~457.2 ng范围内，牛磺胆酸进样量在0.149~373.4 ng范围内线性关系良好。
3.2 检测限与定量限将混合对照品溶液适当稀释后，进样分析；以S/N=3测得胆酸和牛磺胆酸检测限分别为0.26 ng和0.006 1 ng，以S/N=10测得胆酸和牛磺胆酸定量限分别为0.64和0.02 ng。表明仪器的灵敏度较好。
3.3 精密度试验精密吸取混合对照品溶液Ⅱ，进样5 μL，连续进样6次，计算胆酸和牛磺胆酸的RSD分别为2.2%和2.5%，表明仪器的精密度较好。
3.4 重复性试验取同一样品（Gzh_bysh W02037）6份，每份约0.1 g，精密称定，按供试品溶液的制备项方法处理，依法测定，并计算含量；结果胆酸平均含量为7.97 mg·g-1，，RSD为1.7%；牛磺胆酸平均含量为0.99 mg·g-1，RSD为1.9%。
3.5 回收率试验取已测知含量的样品（Gzh_bysh W02037）9份，每份约0.05 g，精密称定，每3份按样品含有量的80%、100%、120%加入对照品，按供试品溶液的制备方法制备所需溶液，并照上述色谱条件测定，计算回收率，结果见表 1。
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表 1 回收率结果 Table 1 Recoveries |
精密吸取同一份供试品溶液（样品Gzh_bysh W02037），进样5 μL，分别在0、2、4、8、12 h进样，计算峰面积RSD，胆酸和牛磺胆酸RSD分别为1.5%和1.3%。结果表明，样品在12 h以内稳定。
4 样品测定按拟定的方法对所收集和制备的安宫牛黄丸进行测定，通过回归方程计算含量，测定结果见表 2。
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表 2 测定结果（mg·g-1，n=2） Table 2 The assay results |
在本次研究中对安宫牛黄丸中胆酸和牛磺胆酸的含量进行测定，结果发现处方标识为体外培育牛黄的安宫牛黄丸样品中胆酸和牛磺胆酸的含量在3.3~8.2 mg·g-1和0.06~1.1 mg·g-1之间，其中企业Jlczh样品的牛磺胆酸和胆酸含量均较低，结果见表 2。对所收集的10批体外培育牛黄和6批人工麝香中胆酸和牛磺胆酸含量进行测定，结果表明体外培育牛黄中胆酸含量在97.0~189.4 mg·g-1之间，牛磺胆酸含量在23.6~40.8 mg·g-1之间；人工麝香中胆酸含量在24.2~27.7 mg·g-1之间。依据安宫牛黄丸中体外培育牛黄和人工麝香的处方量（体外培育牛黄和人工麝香分别占到总处方量的5.0%和0.7%）和转移率（原粉制剂，转移率按照70%计算），安宫牛黄丸中体外培育牛黄的胆酸应在3.5 mg·g-1以上，牛磺胆酸应在0.8 mg·g-1以上，且胆酸和牛磺胆酸主要来自于体外培育牛黄。依据上述限度，所收集的样品中胆酸的含量均基本符合限度要求，但有4个批次牛磺胆酸的含量低于所制订的限度，其中企业Jlczh的样品中牛磺胆酸含量明显低于理论值，可能存在投料量严重不足或者存在重大工艺参数控制偏差。
5.2 安宫牛黄丸中胆酸与牛磺胆酸比例测定结果从上述安宫牛黄丸中胆酸与牛磺胆酸的含量测定结果来看，样品中胆酸含量基本上能满足所设的限度要求，而牛磺胆酸的含量却远远低于拟定限度，通过计算发现个别样品中胆酸与牛磺胆酸的比例远超过其他批次样品，见表 2。依据人工麝香中胆酸的含量结果，安宫牛黄丸中来自于人工麝香的胆酸含量为0.17~0.20 mg·g-1，不到安宫牛黄丸胆酸总量5%，所以安宫牛黄丸中胆酸与牛磺胆酸的比例应与体外培育牛黄中胆酸与牛磺胆酸的比例基本一致，反映的是制剂中体外培育牛黄的质量。实验结果表明体外培育牛黄中胆酸与牛磺胆酸的比例在2.4~7.5之间，结果见表 2。考虑到体外培育牛黄批次之间含量的波动，胆酸与牛磺胆酸的比例应在10左右。通过对安宫牛黄样品中胆酸与牛磺胆酸的比例进行研究，胆酸与牛磺胆酸的比例主要分布在6.7~14.7之间，也与体外培育牛黄的研究结果基本一致，而企业Jlczh样品胆酸和牛磺胆酸比例异常偏高，结果见表 2。采用Ward法对安宫牛黄丸和体外培育牛黄中胆酸与牛磺胆酸比例结果进行聚类分析，结果体外培育牛黄与6个批次安宫牛黄丸样品聚在一起，也表明6个批次安宫牛黄丸样品中胆酸与牛磺胆酸比例与体外培育牛黄基本一致，而企业Jlczh的2批样品单独聚为一类，表明企业Jlczh与体外培育牛黄中胆酸与牛磺胆酸的比例存在明显差异，企业Jlczh中的体外培育牛黄可能存在重大质量风险，应引起生产企业对原料质量的重视，见图 2。相对于单一成分的含量测定结果，通过指标性成分比例的研究，可以对样品中存在的质量问题进行更深入的挖掘和分析，尤其是原料的质量，所能得到的信息更加丰富和完善。
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图 2 安宫牛黄丸和体外培育牛黄中胆酸与牛磺胆酸比例聚类分析结果 Figure 2 The result of cluster analysis of ratio of cholic acid to taurocholate acid in Angong Niuhuang pills and Bovis Calculus Sativus |
本次方法研究前期采用牛磺熊去氧胆酸为内标物进行方法学考察，对比外标法与内标法的方法学数据，并无多大区别，其中方法学数据中牛磺胆酸的较好，但胆酸的方法学数据不理想。推测其中原因，其一前处理方法步骤简单，过程损失较少；其二色谱方法柱后不需要分流，减少可能造成误差；其三采用等度洗脱，目标化合物电离环境未发生变化，离子强度较为稳定，所以内标法的优势未能体现。同时，由于所测成分牛磺胆酸与内标物牛磺熊去氧胆酸均为结合型胆酸，电离行为较为一致，而胆酸为游离型胆酸，与内标物电离行为有较大差异，导致数据质量下降。故本文建立了外标法进行安宫牛黄中牛磺胆酸和胆酸含量测定的方法，其方法学数据均符合中国药典2015年版四部通则9101药品质量标准分析方法验证指导原则的要求。同时，通过上述内标法的初步研究结果，为微量多成分组成的胆汁酸类成分定量研究中内标物的选择提供指导，并为采用同位素和非对映体内标法进行液质联用含量测定方法研究的意义提供了数据支持[15]。
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