2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
2. 山东宏济堂制药集团有限公司, 济南 250100
2. Shandong Hongjitang Pharmaceutical Limited Company, Jinan 250100, China
前列欣胶囊收载于《中国药典》2015年版（一部），主要由桃仁（炒）、没药（炒）、丹参、赤芍、红花、泽兰、王不留行（炒）、皂角刺、败酱草、蒲公英、川楝、白芷、石韦、枸杞子共14种药味组成，具有活血化瘀、清热利湿的功效[1]，临床用于治疗瘀血凝聚，湿热下注所致的慢性前列腺炎及前列腺增生的症状[1]，疗效显著，应用广泛。目前，2015年版《中国药典》（一部）仅采用薄层色谱法结合对照品芍药苷和对照药材没药、白芷进行鉴别，或采用高效液相色谱法测定欧前胡素的含量，质控指标单一，不能全面反应中药方剂多成分、多靶点的特点。有关前列欣胶囊化学成分分析测定的研究仅仅针对其中某一成分进行分析[2-3]，难以反应方剂整体质量。
多指标定量指纹图谱技术是中药质量控制技术发展的新阶段[4-9]，可以较为全面系统地反应中药的特有属性，大大提高中药质量控制水平。高效液相色谱-电喷雾飞行时间质谱（HPLC-DAD-ESI-TOF/MS）技术具有高分离度、高分辨率等特点[10-11]，可以提供化合物的精确分子量信息，用于分子式推断，在中药化学成分分析测定中得到广泛应用[12-16]。本研究发展HPLC-DAD-ESI-TOF/MS技术快速分析测定前列欣胶囊中化学成分的方法，进一步研究多指标定量指纹图谱用于其质量控制的可行性，为提高前列欣胶囊整体质量控制水平提供方法和技术支持。
1 仪器与材料安捷伦1260高效液相色谱仪（自动进样器、梯度泵、柱温箱、二极管阵列检测器）；安捷伦G6520A飞行时间质谱仪，配有电喷雾离子源；美国Agilent ZORBAX SB-C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶），瑞典Kromasil 100-5 C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）。SARTOURIUS公司BSA十万分之一电子分析天平；指纹图谱相似度评价软件为国家药典委员会“中药色谱指纹相似度评价系统”（2004A）；宁波新芝生物科技股份有限公司SB-5200D型高功率数控超声波仪。
对照品没食子酸（批号149-91-7）、绿原酸（批号327-97-9）、咖啡酸（批号331-39-5）、王不留行黄酮苷（批号53452-16-7）、异槲皮苷（批号482-35-9）、丹酚酸B（批号115939-25-8）、丹酚酸A（批号96574-01-5）、隐丹参酮（批号35825-57-1）均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均≥98%。
甲醇、乙腈、甲酸、磷酸为色谱纯，无水乙醇为分析纯，实验用水为密理博超纯水（18 MΩ）。10批前列欣胶囊样品购于济南市各大药店，均为山东宏济堂制药集团有限公司生产，样品信息见表 1。
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表 1 样品来源 Table 1 The origins of the samples |
取胶囊内容物适量，研细，取粉末0.5 g，精密称定，置于具塞锥形瓶中，加入甲醇10 mL，超声（提取功率320 W，频率40 kHz）提取30 min，摇匀，过滤，滤液过0.22 μm微孔滤膜后作为供试品溶液，备用。
2.2 混合对照品储备液的制备精密称取没食子酸、绿原酸、咖啡酸、王不留行黄酮苷、异槲皮苷、丹酚酸B、丹酚酸A、隐丹参酮的对照品各1.0 mg，分别置1 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，配成各化合物质量浓度均为1.0 mg·mL-1的对照品储备液。分别精密吸取上述各对照品储备液100 μL，置于同一1 mL量瓶中，用甲醇定容至刻度，即得混合对照品储备液。
2.3 色谱条件色谱柱：Kromasil 100-5C18（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈（A）-0.8%甲酸水溶液（B），梯度洗脱（0~15 min，5%A→10%A；15~30 min，10%A→20%A；30~50 min，20%A→30%A；50~65 min，30%A→45%A；65~90 min，45%A→100%A；90~100 min，100%A）；流速：0.8 mL·min-1；柱温：25 ℃；检测波长：300 nm；进样量：10 μL。对照品及样品色谱图见图 1。
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1.没食子酸（gallic acid）6.绿原酸（chlorogenic acid）8.咖啡酸（caffeic acid）9.王不留行黄酮苷（vaccarin）12.异槲皮苷（isoquercitrin）17.丹酚酸B（salvianolic acid B）18.丹酚酸A（salvianolic acid A）32.隐丹参酮（cryptotanshinone） 图 1 对照品（A）及样品S1（B）的HPLC色谱图 Figure 1 HPLC chromatograms of reference substances (A) and sample S1 (B) |
进入高分辨电喷雾飞行时间质谱仪的流动相采用三通分流至0.4 mL·min-1。分别采用电喷雾正、负离子模式；全扫描范围m/z 100~1 000；毛细管电压：4.0 kV；喷雾气压：310.28 kPa；干燥气流速：10.0 L·min-1；干燥气温度：325 ℃；裂解电压：100 V；锥孔电压：60 V。
2.5 ESI-TOF/MS鉴别在优化的色谱条件下，采用高分辨电喷雾飞行时间质谱技术，对指纹图谱的各共有峰进行指认。根据获得的化合物的精确分子量信息，DAD检测器获得的紫外吸收信息，并参考相关文献及中国科学院上海有机化学研究所化学专业数据库，对各化合物进行鉴别。鉴别结果与标准对照品进行了对比，以保证结果准确性。结果见表 2。
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表 2 样品中8个化合物的ESI-TOF/MS精确质量测量结果 Table 2 ESI-TOF/MS accurate mass measurements of 8 compounds in samples |
用甲醇将“2.2”项下的混合对照品储备液稀释到37.50、25.00、12.50、5.00、2.50、1.25 μg·mL-1，按“2.3”项下色谱条件进样分析，测定各不同浓度的混合对照品溶液中各化合物的峰面积，以各化合物质量浓度X（μg·mL -1）为横坐标，以峰面积Y为纵坐标，绘制标准曲线，并求得回归方程（见表 3）。用甲醇将1.25μg·mL-1
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表 3 8种化合物的回归方程、线性范围及检测下限、定量下限 Table 3 Regressive equations, linear ranges, LOD and LOQ of the 8 analytes |
混合对照品溶液逐级稀释，进样测定，以3倍信噪比计算各成分的检测限，以10倍信噪比计算定量限，结果见表 3。从表 3可以看出，各标准曲线的相关系数良好，方法灵敏度较高，可以满足前列欣胶囊提取物中各活性组分的含量测定。
2.6.2 精密度试验取S1号样品的供试品溶液，连续进样6次，测得其中8个待测成分的峰面积和保留时间，分别计算其RSD，其保留时间的RSD分别为0.24%、0.14%、0.13%、0.11%、0.03%、0.03%、0.02%、0.01%，均小于1%；峰面积的RSD分别为1.79%、1.90%、2.51%、1.21%、2.74%、3.14%、0.47%、0.96%，均小于5%。结果表明仪器精密度良好。
2.6.3 重复性试验取S1号样品6份，按“2.1”项下方法制成供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件进样测定，测得8个待测成分的峰面积和保留时间，并计算其RSD。结果8个待测成分保留时间的RSD分别为0.52%、0.24%、0.25%、0.18%、0.12%、0.13%、0.12%、0.02%，均小于1%；峰面积的RSD分别为2.63%、1.31%、1.56%、2.69%、1.16%、1.28%、1.97%、1.25%，均小于5%。结果表明方法重复性良好。
2.6.4 稳定性试验取S1号样品的供试品溶液，按照“2.3”项下色谱条件，分别在0、2、4、8、12、24 h进样分析，记录色谱图。结果8个待测成分保留时间的RSD分别为0.33%、0.15%、0.15%、0.12%、0.05%、0.04%、0.03%、0.01%，均小于1%；峰面积的RSD分别为1.83%、2.07%、2.23%、1.28%、2.26%、3.16%、2.73%、1.72%，均小于5%。结果表明供试品溶液中各待测成分在24 h内化学性质稳定。
2.6.5 回收率试验精密称取已知各目标化合物含量的前列欣胶囊样品0.25 g，按“2.1”项下方法制成供试溶液3份，分别精密加入供试品中相应成分的120%、100%、80% 3个水平的混合对照品溶液后，按上述色谱条件进样分析，测定各目标化合物峰面积，计算平均加样回收率，见表 4。从实验结果可知，本方法的回收率良好。
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表 4 加标回收率实验 Table 4 Results of recovery test |
按“2.1”项下方法制备供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件分别进样分析，获得同一厂家10批前列欣胶囊样品中8个化合物色谱峰面积，将测得结果带入表 2线性回归方程，计算前列欣胶囊样品中8个化合物的含量（见表 5）。从表中可以看出，不同批次样品中各活性成分含量差异不大。
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表 5 样品中8个化合物含量测定结果（μg·g-1，n=10） Table 5 Contents of 8 compounds in samples |
取不同批次的前列欣胶囊样品，按“2.1”项下方法制备成供试品溶液，按“2.3”项下色谱条件进样分析，记录色谱图，建立前列欣胶囊的HPLC指纹图谱（见图 2）。在本研究所建立的分析系统下，各样品中分离度较好且稳定出现的峰有34个（见图 2）。计算结果表明，各色谱峰保留时间的RSD均在1%以内，而峰面积的RSD均在5%以内，说明不同批次前列欣胶囊中各共有峰重现性较好，可以选为指纹图谱的共有峰用于其质量评价。
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图 2 前列欣HPLC指纹图谱 Figure 2 HPLC fingerprint of Qianliexin capsule |
通过国家药典委员会“中药色谱指纹图谱相似度评价系统”（2004 A版）对不同批次前列欣胶囊的指纹图谱进行相似度分析。将色谱工作站数据导入中药指纹图谱相似度计算软件，选定上述34个共有峰进行谱峰匹配，采用共有模式作为对照指纹图谱，用于不同批次前列欣胶囊相似度评价，分别采用夹角余弦法和相关系数法用于其相似度计算，结果见表 6。从表中可以看出，不同批次前列欣胶囊的相似度较为接近，说明其质量差别不大，所得结果与多指标含量测定结果一致。
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表 6 相似度评价结果 Table 6 Similarities |
本研究采用超声提取法用于前列欣胶囊的含量测定及指纹图谱研究，同时考察了提取溶剂对提取率的影响。实验采用醇水溶液作为提取溶剂，考察了分别以不同比例醇-水（100%甲醇、70%甲醇、50%乙醇、100%乙醇）作为提取溶剂时的提取效果，所得提取液按照2.3色谱条件进行分析，结果表明，当采用纯甲醇作为提取溶剂时，色谱峰较多，各峰分布均匀，峰强度较好，因此选择纯甲醇作为前列欣胶囊提取溶剂。
3.2 色谱条件优化前列欣胶囊由14种中药配伍而成，化学成分种类较多。选择了2根不同的反相色谱柱Agilent ZORBAX SB-C18和Kromasil 100-5C18进行分析，结果表明，采用Kromasil 100-5C18色谱柱前列欣胶囊提取物中各化合物分离效果较好。采用等度洗脱难以实现其分离，因此采用梯度洗脱用于其分离研究。考察了甲醇-水和乙腈-水作为流动相时的效果，结果表明采用乙腈-水作为流动相时各峰分离度较好，分布均匀，因此选择乙腈-水作为流动相用于前列欣胶囊提取物的分离研究。针对部分色谱峰的拖尾现象，进一步考察了流动相加入不同比例弱酸（0.2%甲酸、0.4%甲酸、0.6%甲酸、0.8%甲酸）对色谱分离的影响，结果表明，水相中加入0.8%甲酸时各色谱峰分离度较好，峰形尖锐。经紫外检测器考察样品在不同波长（190~400 nm）下的色谱图，结果表明，选择300 nm时，样品HPLC色谱峰较多，基线稳定，因此，选择300 nm作为样品含量测定及指纹图谱的检测波长。
4 小结本研究根据前列欣胶囊质控指标单一，现有质量标准不能满足实际生产质控等不足，建立了前列欣胶囊的指纹图谱。研究表明，HPLC-DAD-ESI-TOF/MS技术可以快速鉴别和测定前列欣胶囊中多种化学成分。采用前列欣胶囊指纹图谱结合相似度分析，可以用于其质量控制和评价研究。本研究对提高前列欣胶囊的质量控制水平提供了方法和技术支持。
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