龙血通络胶囊中化学成分的RRLC-Q-TOF MS分析

成分分析

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秦建平, 潘有智, 郎悦, 黄文哲, 萧伟, 屠鹏飞, 朱靖博, 王永华. 龙血通络胶囊中化学成分的RRLC-Q-TOF MS分析[J]. 药物分析杂志, 2017, 37(10): 1782-1790. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.10.07.

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QIN Jian-ping, PAN You-zhi, LANG Yue, HUANG Wen-zhe, XIAO Wei, TU Peng-fei, ZHU Jing-bo, WANG Yong-hua. Characterization of constituents in Longxue Tongluo capsules by RRLC-Q-TOF MS[J]. Chinese Journal of Pharmaceutical Analysis, 2017, 37(10): 1782-1790. DOI: 10.16155/j.0254-1793.2017.10.07.

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基金项目

国家科技部“重大新药创制”—现代中药创新集群与数字制药技术平台（2013ZX09402203）；江苏省科技成果转化项—脑梗塞（恢复期）治疗药物龙血通络胶囊的国际合作研发及产业化（BA2013012）

第一作者

秦建平, Tel:(0518)81152321, E-mail:qinjianping111@126.com。

通信作者

萧伟, Tel:(0518)81152367, E-mail:kanionlunwen@163.com

文章历史

收稿日期：2016-12-05

Contents Abstract Full text Figures/Tables PDF

龙血通络胶囊中化学成分的RRLC-Q-TOF MS分析

秦建平 ^1,2, 潘有智 ^1,2, 郎悦 ^1,2, 黄文哲 ^1,2, 萧伟 ^1,2, 屠鹏飞 ³, 朱靖博 ⁴, 王永华 ⁵

1. 江苏康缘药业股份有限公司, 连云港 222001;
2. 中药制药过程新技术国家重点实验室, 连云港 222001;
3. 北京大学药学院天然药物学系, 北京 100191;
4. 大连工业大学食品学院, 大连 116034;
5. 西北农林科技大学生命科学学院, 杨凌 712100

收稿日期：2016-12-05

基金项目：国家科技部“重大新药创制”—现代中药创新集群与数字制药技术平台（2013ZX09402203）；江苏省科技成果转化项—脑梗塞（恢复期）治疗药物龙血通络胶囊的国际合作研发及产业化（BA2013012）

第一作者：秦建平, Tel:(0518)81152321, E-mail:qinjianping111@126.com

通信作者：萧伟, Tel:(0518)81152367, E-mail:kanionlunwen@163.com

摘要：目的：采用快速液相色谱结合四极杆飞行时间串联质谱分析龙血通络胶囊中的主要化学成分。方法：采用Kromasil C₁₈（4.6 mm×150 mm，3.5 μm）色谱柱，流动相为乙腈-0.1%甲酸水溶液，梯度洗脱，流速1.0 mL·min^-1，柱温30 ℃，进样体积5 μL；质谱定性鉴别采用正负离子扫描模式，毛细管电压4 kV，雾化气压力275.8 kPa，干燥气流速10 L·min^-1，加热毛细管温度350 ℃，质量数扫描范围m/z 100~1 000，碰撞能量为15~30 V。结果：通过四极杆串联飞行时间质谱和碎片离子裂解分析，从龙血通络胶囊中鉴定出32个化学成分，包括29个黄酮类成分和3个二苯乙烯类成分，其中15个成分经由对照品比对确证。结论：所建立的RRLC-Q-TOF MS方法，可为鉴定龙血通络胶囊中化学成分提供一种快速、高效的方法，对其质量控制和药效物质基础研究具有重要意义。

关键词：龙血通络胶囊化学成分鉴定黄酮类二苯乙烯类快速液相色谱四极杆串联飞行时间质谱

Characterization of constituents in Longxue Tongluo capsules by RRLC-Q-TOF MS

QIN Jian-ping^1,2, PAN You-zhi^1,2, LANG Yue^1,2, HUANG Wen-zhe^1,2, XIAO Wei^1,2, TU Peng-fei³, ZHU Jing-bo⁴, WANG Yong-hua⁵

1. Jiangsu Kanion Pharmaceutical Co. Ltd., Lianyungang 222001, China;
2. State Key Laboratory of Pharmaceutical Process New-tech for Chinese Medicine, Lianyungang 222001, China;
3. School of Pharmaceutical Science, Peking University, Beijing 100191, China;
4. College of Food Science, Dalian Polytechnic University, Dalian 116034, China;
5. College of Life Sciences, Northwest Agriculture & Forestry University, Yangling 712100, China

Abstract: Qbjective: To analyze and identify the chemical constituents of Longxue Tongluo capsules by rapid resolution liquid chromatography-quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry(RRLC-Q-TOF MS).Methods: A Kromasil C₁₈(4.6 mm×150 mm, 3.5 μm)column was used for chromatographic separation with column temperature maintained at 30 ℃.Acetonitrile and 0.01% formic acid were employed as mobile phase in a gradient elution program.The flow rate was set at 1.0 mL·min^-1 and the injection volume was 5 μL.Quadrupole time-of-flight tandem mass spectrometry(Q-TOF MS)was applied to qualitative analysis in both positive and negative ion modes.The capillary voltage was 4 kV and the nebulizer gas pressure was 275.8 kPa.The flow rate of the drying gas was 10 L·min^-1 at a temperature of 350 ℃.The MS scan range was m/z 100-1 000.The collision energy was 15-30 V.Results: A total of 32 chemical constituents were identified in Longxue Tongluo capsules including 29 flavonoids and 3 stilbenoids, 15 of which were unambiguously identified via comparison with chemical standards.Conclusion: A rapid and efficient RRLC-Q-TOF MS approach was established for studying the chemical constituents in Longxue Tongluo capsules.Furthermore, this study was significant to the quality control and the effective substances investigation of Longxue Tongluo capsules.

Key words: Longxue Tongluo capsules identification of chemical constituent flavonoids stilbenoids RRLC Q-TOF MS

龙血通络胶囊（原名为龙血通胶囊）是由中药龙血竭经提取精制获得酚类有效部位后制成的制剂，具有活血化瘀通络之功效，用于中风病中经络恢复期血瘀证的治疗。近年来，龙血通络胶囊处方中药味龙血竭的化学成分有了一定程度的研究，所含化学成分主要为酚类^[1-6]、皂苷类^[7-8]和甾醇类成分^[9]，但是经提取精制后的龙血通络胶囊化学成分尚未见报道。本文采用RRLC-Q-TOF MS方法，对龙血通络胶囊中化学成分进行鉴别和结构解析，为阐明该品种物质基础和提高质量控制水平提供实验基础。

1 仪器与试药

Agilent 1290-6538 Q-TOF液质联用仪、电喷雾（ESI）离子源（Agilent公司）；Kromasil C₁₈色谱柱（150 mm×4.6 mm，3.5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶；Eka Chemicals公司）；Mettler AE240电子分析天平（精度为万分之一）、Mettler XP-6电子（精度为百万分之一）（梅特勒公司）；Centrifuge 5415D高速离心机（Eppendorf公司）；KQ-250DB型超声波清洗仪（昆山超声仪器有限公司）；Milli-Q Academic纯水机（密理博公司）。

对照品龙血素A（批号111660-200402）、龙血素B（批号111558-201407）、7，4′-二羟基黄酮（批号111787-201002）、白藜芦醇（批号111535-200502）、芹菜素（批号111901-201102）均购自中国食品药品检定研究院；7-羟基黄酮（批号229-705-3，质量分数大于97%）购自TCI公司；紫檀茋（批号20110723，质量分数大于99%）购自杭州广林生物医药科技有限公司；甘草素（批号MUST-15021104，质量分数99.07%）购自成都曼斯特公司；对照品10-羟基-11-甲氧基龙血酮为大连工业大学朱靖博老师赠送，HPLC面积归一化法计算质量分数均大于98%；对照品2，6-二甲氧基-4，4′-二羟基二氢查耳酮、2-甲氧基-4，4′-二羟基二氢查耳酮、7，4′-二羟基高异黄烷、7，4′-二羟基-8-甲氧基高异黄烷、2，6-二甲氧基-4′-羟基二氢查耳酮、4，4′-二羟基-3′-甲氧基查耳酮为实验室自制，经波谱（LC-MS和NMR）进行结构确证，HPLC面积归一化法计算质量分数均大于98%。

乙腈、甲酸为色谱纯，水为超纯水，其余试剂均为分析纯。

龙血通络胶囊（批号150601）由江苏康缘药业股份有限公司生产。

2 方法 2.1 色谱条件

采用Kromasil C₁₈（150 mm×4.6 mm，3.5 μm）色谱柱，以乙腈（A）-0.1%甲酸水溶液（B）为流动相，梯度洗脱（0~18 min，25%A→40%A；18~33 min，40%A→45%A；33~45 min，45%A→95%A），流速1.0 mL·min^-1（分流进入质谱接口的流速约为0.4 mL·min^-1），柱温30 ℃，进样量5 μL。

2.2 质谱条件

采用ESI离子源，正、负离子扫描模式，毛细管电压4 kV，雾化气压力275.8 kPa，干燥气流速10 L·min^-1，加热毛细管温度350 ℃，源内裂解电压135 V，质量扫描范围m/z 100~1 000，碰撞能量为15~30 V。

2.3 对照品溶液的制备

取上述“1”项中15种对照品适量，分别加甲醇制成每1 mL含15 µg的单一对照品溶液。

2.4 供试品溶液的制备

取龙血通络胶囊内容物，研细，取粉末约0.25 g，加70%乙醇水25 mL，超声提取（功率250 W，频率40 kHz）30 min，放冷，滤过，取续滤液过0.22 μm滤膜，即得。

3 结果

按“2.1”和“2.2”项中分析条件，龙血通络胶囊中化学成分能得到较好的分离，对其进行正、负离子模式分析，得到其RRLC-Q-TOF MS总离子流（TIC）色谱图（图 1）。本文采用的化合物鉴定基本流程：首先通过正负离子质谱信息、离子丰度等方法确定色谱峰的准分子离子，根据Q-TOF MS的精确相对分子质量及同位素分布情况得到分子式，结合文献报道^{[1-2, 10-15]}推断出可能的候选化合物，再采用响应较好的离子模式进行Q-TOF MS/MS分析，结合Q-TOF MS/MS碎片信息、对照品裂解情况和文献进行推断。采用本法共鉴定出龙血通络胶囊中32个化合物，其中通过对照品数据推断出15个化合物，通过文献数据^{[1-3, 9-15]}推断出17个化合物。具体结果如表 1所示。

图 1 龙血通络胶囊的RRLC-Q-TOF MS总离子流图 Figure 1 The total ion chromatograms of Longxue Tongluo capsules obtained by RRLC-Q-TOF MS

表 1 龙血通络胶囊化学成分鉴定分析结果 Table 1 Identification results of chemical constituents in Longxue Tongluo capsules

峰号（peak No.）	t_R/min	测量值（observed m/z）	分子式（molecular formula）	误差（error）/×10^-6	主要碎片离子（major fragments）	化合物（compounds）
1	2.94	319.118 2[M+H]⁺ 317.102 8[M-H]^-	C₁₇H₁₈O₆	-1.76 0.82	147.044 9[M-H-B]^-，93.034 8[A-H]^-	cochinchinenone
2	5.03	317.102 4[M+H]⁺ 315.087 4[M-H]^-	C₁₇H₁₆O₆	-1.38 0.08	209.044 5[⁵A-H]^-，181.050 8[^1，3A-H]^-	7，8-亚甲二氧基-5，6，4′-三羟基高异黄烷（7，8-methylenedioxy-5，6，4′-trihydroxy homoisoflavan）
3	5.34	287.091 9[M+H]⁺ 285.076 7[M-H]^-	C₁₆H₁₄O₅	-1.65 0.48	165.019 0 C₅H₈O₄，119.049 6[M-H-A-CO₂]^-	4，3′，4′-三羟基-5′-甲氧基查耳酮（4，3′，4′-trihydroxy-5′-methoxy chalcone）
4^*	6.11	255.065 4[M+H]⁺ 253.050 7[M-H]^-	C₁₅H₁₀O₄	-1.02 -0.21	135.008 2[^1，3A-H]^-，117.034 2[^1，3B-H]^-，91.018 8[^1，3A-H-CO₂]^-	7，4′-二羟基黄酮（7，4′-dihydroxyflavone）
5	6.65	285.076 3[M+H]⁺ 283.061 2[M-H]^-	C₁₆H₁₂O₅	-1.83 0.13	268.037 6[M-H-CH₃·]^-·，240.042 7[M-H-CH₃·-CO]^-·，135.008 4[^1，3A-H]^-，91.018 7[^1，3A-H-CO₂]^-	7，3′-二羟基-4′-甲氧基黄酮（7，3′-dihydroxy-4′-methoxyflavone）
6^*	6.98	229.086 1[M+H]⁺ 227.071 1[M-H]^-	C₁₄H₁₂O₃	-0.89 1.14	185.060 9[M-H-C₂H₂O]^-，143.050 4[M-H-2C₂H₂O]^-	白藜芦醇（resveratrol）
7	7.01	301.107 7[M+H]⁺ 299.092 9[M-H]^-	C₁₇H₁₆O₅	-2.04 -1.31	193.050 1[⁵A-H]^-	7，4′-二羟基-8-甲氧基高异黄烷酮（7，4′-dihydroxy-8-methoxy homoiso-flavanone）
8^*	7.49	285.112 5[M+H]⁺	C₁₇H₁₆O₄	-1.28	270.089 5[M-H-CH₃·]^-·	10-羟基-11-甲氧基龙血酮（10-hydroxy-11-methoxydracaenone）
9^*	8.15	255.066 0[M-H]^-	C₁₅H₁₂O₄	1.04	135.007 8[^1，3A-H]^-，119.049 2[^1，3B-H]^-，91.018 5[^1，3A-CO₂-H]^-	甘草素（7，4′-dihydroxyflavanone）
10	8.31	289.107 4[M+H]⁺ 287.092 2[M-H]^-	C₁₆H₁₆O₅	-1.23 0.93	193.049 7[M-H-A]^-，147.044 8[M-H-B]^-，139.039 8[B-H]^-135.045 0[^yA-H]^-，93.034 4[A-H]^-	2，4，4′-三羟基-6-甲氧基二氢查耳酮（2，4，4′-trihydroxy-6-methoxy dihydro-chalcone）
11	8.58	525.192 9[M+H]⁺ 523.175 9[M-H]^-	C₃₂H₂₈O₇	-4.04 0.56	429.133 1 C₂₆H₂₁O₆，371.091 2 C₂₃H₁₅O₅，293.081 9 C₁₈H₁₃O₄，93.034 7 C₆H₅O	dracaenin A
12^*	9.95	271.097 1[M+H]⁺ 269.081 7[M-H]^-	C₁₆H₁₄O₄	-2.12 0.77	253.050 4[M-H-CH₄]^-，225.055 4[M-H-CH₄-CO]^-	4，4′-二羟基-3′-甲氧基查耳酮（4，4′-dihydroxy-3′-methoxy chalcone）
13	10.57	271.096 8[M+H]⁺ 269.081 7[M-H]^-	C₁₆H₁₄O₄	-1.33 0.77	163.039 7[M-H-CH₄-A]^-，119.049 7[M-H-A-CO₂]^-	4，4′-二羟基-2-甲氧基查耳酮（4，4′-dihydroxy-2-methoxy chalcone）
14^*	11.87	271.060 3[M+H]⁺ 269.045 2[M-H]^-	C₁₅H₁₀O₅	-1.02 1.30	225.054 9[M-H-CO₂]^-，151.003 5 [^1，3A-H]^-，117.034 5 [^1，3B-H]^-	芹菜素（apigenin）
15^*	12.15	273.112 5[M+H]⁺ 271.097 6[M-H]^-	C₁₆H₁₆O₄	-1.43 0.09	135.045 3 [^yA-H]^-	4，4′-二羟基-2-甲氧基二氢查耳酮（4，4′-dihydroxy-2-methoxy dihydro-chalcone）
16^*	13.03	303.123 3[M+H]⁺ 301.108 1[M-H]^-	C₁₇H₁₈O₅	-2.13 0.17	135.045 0 [^yA-H]^-，93.034 2 [A-H]^-	4，4′-二羟基-2，6-二甲氧基二氢查耳酮（4，4′-dihydroxy-2，6-dimethoxy dihydro-chalcone）
17^*	14.04	239.070 2[M+H]⁺ 237.055 7[M-H]^-	C₁₅H₁₀O₃	0.16 0.12	101.039 4[^1，3B-H]^-，91.018 8[^1，3A-CO₂-H]^-	7-羟基黄酮（7-hydroxyflavone）
18	14.95	287.091 0[M+H]⁺ 285.076 7[M-H]^-	C₁₆H₁₄O₅	1.39 0.41	179.034 8[M-H-B]^-，135.044 8[M-H-B-CO₂]^-	5，7-二羟基-4′-甲氧基二氢黄酮（5，7-dihydroxy-4′-methoxyflavonone）
19	15.81	243.101 8[M+H]⁺ 241.086 7[M-H]^-	C₁₅H₁₄O₃	-1.15 1.40	225.055 3[M-H-CH₄]^-，183.046 4[M-H-CH₄-C₂H₂O]^-	3，4′-二羟基-5-甲氧基二苯乙烯（3，4′-dihydroxy-5-methoxy stilbene）
20^*	16.12	257.117 4[M+H]⁺ 255.102 0[M-H]^-	C₁₆H₁₆O₃	-0.70 2.62	149.061 2[^0，3B-H]^-，121.030 1[^1，3A-H]^-，105.033 8[^0，3A-H]^-	7，4′-二羟基高异黄烷（7，4′-dihydroxy homoisoflavan）
21^*	16.48	287.128 2[M+H]⁺ 285.112 8[M-H]^-	C₁₇H₁₈O₄	-1.44 1.52	270.090 8[M-H-CH₃·]^-·，164.047 3[⁵A-H-CH₃·]^-·，136.016 7[^1，3A-H-CH₃·]^-·	7，4′-二羟基-8-甲氧基高异黄烷（7，4′-dihydroxy-8-methoxy homoi-soflavan）
22^*	17.34	303.123 5[M+H]⁺ 301.107 9[M-H]^-	C₁₇H₁₈O₅	-2.60 0.83	135.045 1[^yA-H]^-，93.034 5[A-H]^-	2，4′-二羟基-4，6-二甲氧基二氢查耳酮（2，4′-dihydroxy-4，6-dimethoxy dihydro-chalcone）
23	18.57	485.197 2[M+H]⁺ 483.180 6[M-H]^-	C₃₀H₂₈O₆	-2.79 1.41	253.087 2 C₁₆H₁₃O₃，227.071 9 C₁₄H₁₁O₃，149.061 7 C₉H₉O₂，93.034 8 C₆H₅O	cochinchinenene D
24	22.79	285.111 3[M+H]⁺ 283.097 4[M-H]^-	C₁₇H₁₆O₄	2.93 0.72	134.037 8[^1，3B-H]^-·，120.022 5[^0，4A-H]^-·	7，8-亚甲二氧基-4′-羟基高异黄烷（7，8-methylenedioxy-4′ -hydroxy homoisoflavane）
25^*	23.58	287.128 4[M+H]⁺ 285.112 8[M-H]^-	C₁₇H₁₈O₄	-2.26 1.52	149.061 7[M-H-B]^-，134.037 3[^yA-H]^-·	4′-羟基-2，6-二甲氧基二氢查耳酮（4′-hydroxy-2，6-dimethoxy dihydrochalcone）
26^*	24.84	287.127 0[M+H]⁺ 285.113 3[M-H]^-	C₁₇H₁₈O₄	2.74 -0.10	134.037 4[^yA-H]^-·，120.021 7[^xA-H]^-·，92.026 9[A-H]^-·	龙血素A（loureinin A）
27^*	25.59	317.138 3[M+H]⁺ 315.123 8[M-H]^-	C₁₈H20O5	0.16 0.09	147.045 1[M-H-B]^-，134.037 1[^yA-H]^-·，120.021 5[^xA-H]^-·，92.026 7[A-H]^-·	龙血素B（loureinin B）
28	28.05	543.239 0[M+H]⁺ 541.223 1[M-H]^-	C₃₃H₃₄O₇	-2.25 0.13	311.129 4 C₁₉H₁₉O₄，119.050 2 C₈H₇O，93.034 0 C₆H₅O	Cochinchinenin B/ Cochinchinenin C
29	28.36	543.239 1[M+H]⁺ 541.223 0[M-H]^-	C₃₃H₃₄O₇	-2.43 0.33	311.129 7 C₁₉H₁₉O₄，119.049 9 C₈H₇O，93.034 3 C₆H₅O	Cochinchinenin B/ Cochinchinenin C
30	29.50	511.211 9[M-H]^-	C₃₂H₃₂O₆	1.43	391.153 8 C₂₄H₂₃O₅，119.049 4 C₈H₇O，361.144 8 C₂₃H₂₁O₄，149.060 2 C₉H₉O₂	（2R）-8-methylsocotrin-4′-ol
31^*	31.75	257.117 5[M+H]⁺ 255.102 5[M-H]^-	C₁₆H₁₆O₃	-1.15 0.70	240.077 4[M-H-CH₃·]^-·，225.054 5[M-H-2CH₃·]^-	紫檀茋（pterostilbene）
32	40.62	527.242 2[M+H]⁺ 525.227 8[M-H]^-	C₃₃H₃₄O₆	0.88 1.23	387.160 6 C₂₅H₂₃O₄，373.142 0 C₂₄H₂₁O₄，359.125 8 C₂₃H₁₉O₄，253.085 8 C₁₆H₁₃O₃，149.060 6 C₉H₉O₂，135.045 5 C₈H₇O₂，121.029 4 C₇H₅O₂	cochinchinenene A/ cochinchinenene G
注（note）：“”表示经对照品比对确认的成分（“” means constituents identified with standards）

表 1 龙血通络胶囊化学成分鉴定分析结果 Table 1 Identification results of chemical constituents in Longxue Tongluo capsules

3.1 黄酮类成分的鉴定

由表 1可知，龙血通络胶囊中含有多个黄酮类成分，其中大多数是黄酮苷元，包括黄酮、二氢黄酮、黄烷、高异黄烷、二氢查耳酮和黄酮二聚体。

3.1.1 黄酮、二氢黄酮和黄烷酮的鉴定

化合物4、5、14和17为黄酮，化合物18为二氢黄酮，化合物9为黄烷酮，化合物7为高异黄烷酮。一级扫描中产生[M+H]⁺和[M-H]^-离子，实验选择灵敏度好、干扰小的[M-H]^-离子进行MS/MS分析。黄酮苷元易中性丢失CO、CO₂和发生Retro-Diels-Alder（RDA）裂解。以化合物4（7，4′-二羟基黄酮）为例，在负离子模式下，产生高丰度的m/z 253.05 [M-H]^-，将此离子作为母离子进行MS/MS的碰撞诱导裂解，可进一步发生RDA裂解产生碎片离子峰m/z 135.01（C₇H₃O₃）和117.04（C₈H₅O），m/z 135.01（C₇H₃O₃）进一步中性丢失CO₂产生m/z 91.02（C₆H₃O），其裂解路径见图 2，化合物5、14和17发生类似裂解。化合物5含有甲氧基，易丢失CH₃·产生m/z 268.04的离子，然后中性丢失CO产生m/z 240.04的离子，同时发生与上述黄酮一致的RDA裂解，根据文献^[10-12]将其鉴定为7，3′-二羟基-4′-甲氧基黄酮。

图 2 7，4′-二羟基黄酮RDA裂解途径示意图 Figure 2 Fragmentation pathways of 7, 4′-dihydroxyflavone

3.1.2 查耳酮及二氢查耳酮的鉴定

化合物1、3、10、12、13、15、16、22、25、26和27在一级扫描中产生较强[M+H]⁺和[M-H]^-离子，实验选择灵敏度好、干扰小的[M-H]^-离子进行MS/MS分析，该类化合物在进行MS²分析时A环与B环之间的连接键易发生断裂。以龙血素B（化合物27）为例，龙血素B在UPLC-Q-TOF MS下产生高丰度的m/z 317.14 [M+H]⁺和m/z 315.12 [M-H]^-，以[M-H]^-离子进行MS²分析，主要碎片离子为m/z 147.04（C₉H₇O₂）、134.04（C₈H₆O₂）、120.02（C₇H₄O₂）和92.03（C₆H₄O），其裂解路径见图 3。其他化合物发生类似裂解，根据对照品比对情况和文献^{[2, 9-10, 13]}报道判断化合物10、15、16、22、25、26和27为二氢查耳酮，化合物1为二氢查耳酮变体，化合物3、12和13为查耳酮，详见表 1。

图 3 龙血素B裂解途径示意图 Figure 3 Proposed fragmentation pathways for loureinin B in the negative ion mode

3.1.3 高异黄烷类化合物的鉴定

化合物2、20、21和24为高异黄烷，化合物8为1个变形的高异黄烷，在UPLC-Q-TOF MS下产生[M+H]⁺和[M-H]^-，其裂解途径主要为RDA裂解，与“3.1.1”项黄酮类化合物类似。以7，4′-二羟基-8-甲氧基高异黄烷（化合物21）为例，因含有甲氧基，易丢失CH₃·产生m/z 270.09 [M-H-CH₃·]-，然后发生RDA裂解或在C₃-C₉位发生苄基的断裂，其裂解路径见图 4。

图 4 7，4′-二羟基-8-甲氧基高异黄烷裂解途径示意图 Figure 4 Proposed fragmentation pathways for 7, 4′-dihydroxy-8-methoxy homoisoflavan in the negative ion mode

3.1.4 黄酮寡聚体类化合物的鉴定

根据UPLC-Q-TOF MS正负离子情况结合文献^{[2, 9, 15]}，初步判断化合物11、23、28、29、30和32为黄酮寡聚体。该类化合物除发生2个苷元连接键的断裂外，主要裂解途径与其组成的苷元类似。以（2R）-8-methylsocotrin-4′-ol（化合物30）为例，其裂解路径见图 5。

图 5 （2R）-8-methylsocotrin-4′-ol裂解途径示意图 Figure 5 Proposed fragmentation pathways for(2R)-8-methylsocotrin-4′-ol in the negative ion mode

3.2 其他类成分的鉴定

化合物6、19和31为二苯乙烯类化合物，在负离子模式下，均产生高丰度的[M-H]^-离子，正离子模式下也能产生[M-H]⁺离子，但强度较弱，因此，选择[M-H]^-做母离子用于获取碎片离子。白藜芦醇（化合物6）在二级碎裂过程中，两环依次丢失一分子的C₂H₂O而出现高丰度的碎片离子峰m/z 185.06（C₁₂H₉O₂）和m/z 143.05（C₁₀H₇O），其裂解途径见图 6；化合物19和31的裂解过程与白藜芦醇相似，但是由于其含有甲氧基，故同时易丢失CH₃·基团。

图 6 白藜芦醇裂解途径示意图 Figure 6 Proposed fragmentation pathways for resveratrol in the negative ion mode

4 讨论

本试验供试品溶液的制备方法参考了文献^[16]，也考察了70%乙醇、50%乙醇和乙醇提取情况，结果50%乙醇提取效果稍差，乙醇与70%乙醇提取效果无明显差别，最终确定了本文的制备方法。通过对RRLC色谱条件进行考察和优化，使各色谱峰达到较好的分离，结合碎片分析及大量对照品的使用，能较好地区分龙血通络胶囊中存在的同分异构体。

采用上述方法对龙血通络胶囊中化学成分进行了质谱分析，结合对照品的裂解规律及文献报道，共鉴别出32个化合物，其中29个为黄酮类化合物，3个为二苯乙烯类化合物，15个化合物经对照品比对确证。本研究结果为后期开展龙血通络胶囊质量控制、作用机制与体内过程研究提供依据和可借鉴的分析方法。

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