2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
血清泌乳素（prolactin，PRL）主要由垂体前叶分泌，最早因其具有刺激泌乳作用而被发现[1-2]，之后又发现PRL在渗透调节[1-2]、免疫调节[3-6]和血管生成[7]等方面具有稳态作用。血清PRL的测定在临床上主要应用于垂体功能评估[8-10]、乳素瘤诊断和监测[11-13]、溢乳监测[14]以及自身免疫疾病[15]等的临床诊断和监测。
人垂体PRL第3次国际标准品（批号84/500，以下简称84/500）建立于1988年，是PRL国家标准品和各种PRL免疫分析试剂溯源时使用的一级标准品，广泛用于全世界范围内免疫测定人血清和血浆中PRL的校准。由于该批标准品存量几乎耗尽，亟需更换。因此在2015年WHO开展了建立PRL第4次国际标准品的协作标定研究。PRL第4次国际标准品候选品来自20世纪80年代制备的一批批号为83/573的样品（以下简称83/573）。另外，为促进未来PRL国际标准品原料选择的多样性，WHO将重组来源PRL国际参考品（批号97/714，以下简称97/714）一并纳入研究。本次研究中还包括16份含有正常及高值PRL的人血清样本。这次协作标定的研究目的是：（1）采用免疫分析，以84/500标定83/573；（2）评价83/573作为第4次国际标准品用于PRL免疫分析校准的适用性；（3）评价83/573的稳定性；（4）评价重组来源的97/714在目前PRL免疫分析中的免疫活性，以了解未来标准化战略。
中国食品药品检定研究院非传染病诊断试剂室代表中国实验室应邀参加了此次国际协作标定研究。全球共有7个国家的10个实验室参加了这次研究。
1 实验材料 1.1 样本84/500，效价为53 mIU·安瓿-1，每安瓿含1 mL的PRL提取物、1 mg人血白蛋白、5 mg乳糖、0.63 mg甲酸铵的溶液冻干后残余物；经检测，HBsAg、抗-HIV和HCV NAT阴性。
83/573，理论效价为63 mIU·安瓿-1，包括正常保存状态及经热加速降解处理样本（分别保存于4、20、37和45 ℃条件下10个月），每安瓿含1 mL的PRL提取物、1 mg人血白蛋白、5 mg乳糖、0.63 mg甲酸铵的溶液冻干后残余物；经检测，HBsAg、抗-HIV和HCV NAT阴性。
97/714，效价为1 400 mIU·安瓿-1，每安瓿含1 mL的重组PRL24.5μg、4.5 mg氯化钠、3 mg精氨酸、4.0 mg磷酸钠、0.1 mg Tween20、30 mg海藻糖的溶液冻干后残余物。
16份人血清样本（编号S1~S16），每支含0.5~1.0 mL，PRL浓度在150~3 800 mIU·L-1范围内，来自2个商业机构。经检测，HIV Ⅰ/Ⅱ抗体、HIV p24、HbsAg、anti-HCV和梅毒螺旋体阴性。5种样本均以字母编号并给出理论效价，具体编号、效价详见表 1。因血清样本入关受限，本实验室仅被分派到84/500、83/573（编号为C）和97/714的标准品。
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表 1 协作标定中的样本 Table 1 Preparations for inclusion in the collaborative study |
本次国际协作标定用的试剂盒，包括化学发光免疫法、磁微粒酶联免疫法、放射免疫法及时间分辨免疫荧光法4种方法的共9种试剂盒：催乳素定量测定试剂盒（化学发光法），郑州安图生物工程股份有限公司；泌乳素测定试剂盒（化学发光法），四川迈克生物科技股份有限公司；泌乳素测定试剂盒（化学发光法），贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司；促乳素测定试剂盒（化学发光法），索灵诊断医疗设备（上海）有限公司；催乳素检测试剂盒（电化学发光法），罗氏诊断产品（上海）有限公司；催乳素测定试剂盒（直接化学发光法，ADVIA Centaur系统），西门子医学诊断产品（上海）有限公司；泌乳素定量检测试剂盒（磁微粒分离酶联免疫法），北京倍爱康生物技术有限公司；碘[125I]人泌乳素放射免疫分析药盒，北京北方生物技术研究所；人泌乳素定量检测试剂盒（时间分辨免疫荧光分析法），广州市达瑞抗体工程技术有限公司。
1.3 分析缓冲液冻干样本的复溶采用0.01 mol·L-1 PBS（含0.1% BSA，pH7.2~7.4），复溶后各样本溶液采用各试剂盒专用稀释液配制。
2 WHO对国际协作标定实验的要求 2.1 实验操作收到样本后应置于-20 ℃或以下保存。使用前需将安瓿恢复至室温以减少水分吸收。应采用适当分析缓冲液或含0.1%BSA的PBS充分溶解安瓿内容物以得到储存液。注意：缓冲液应该含有蛋白以防止表面吸附作用（通常为0.1%牛血清白蛋白或0.1%的人血清白蛋白）。如果在后续的分析中不能使用新鲜开封的安瓿，建议将储存液分装，并置于-20 ℃及以下保存。各实验室每种方法至少进行2次独立分析，每次分析均应包含分配的所有样品。为比较不同免疫学分析方法，需要所有参加者配制的部分样本剂量水平一致，因此在每次分析中，每个样品至少包含5个核心剂量水平（125、250、500、1 000、2 000 mIU·L-1），每个水平至少3次重复（手工操作试剂可2次重复）。血清样本使用前应恢复至室温，且充分混匀。因血清样本稳定性未知，恢复室温后应立即进行检测。可采用分装的冰冻血清。
2.2 实验记录各实验室需提供各样本复溶及稀释、分析方法的详细信息和原始试验数据（如光密度值、发光值等），并提交Excel形式的电子版至NIBSC，以及本实验室计算得到的各样本PRL浓度值。
3 实验方法本次协作标定实验过程中严格按照WHO的要求进行操作。
3.1 样品复溶与系列溶液配制除1个试剂盒上采用专用稀释液复溶外，其余实验中，均采用2.0 mL含0.1%BSA的0.01 mol·L-1 PBS复溶，得到原液，再采用各试剂盒专用稀释液，在各试剂盒的线性范围内，配制至少5个剂量水平，其中包括NIBSC要求的5个核心剂量水平。
3.2 剂量-反应曲线制作各方法的每次独立实验中，包括1条84/500、1条83/573、1条97/714以及1条试剂盒校准品的剂量-反应曲线，每条剂量-反应曲线含7~10个剂量水平，每个剂量水平重复测定3次。
3.3 实验操作所有免疫分析操作按各试剂盒说明书提供的方法进行。
3.4 数据处理放射免疫分析法采用log（dose）-logit（B/B0）数学模型拟合，其余双抗体夹心法免疫分析均采用双对数log（dose）-log（cpm/OD/RLU）数学模型拟合。同时分析测定83/573、97/714与相应剂量水平的84/500，用双对数数学模型拟合，t检验分析83/573、97/714与84/500的剂量-反应曲线是否平行。在平行的前提下，以84/500剂量-反应曲线为标准曲线，计算各样本的实测值与理论值的效价比，最终得到各样本的免疫效价。t检验结果不平行的数据，不纳入计算。
4 实验结果 4.1 免疫活性测定以84/500为标准品，计算83/573和97/714的免疫效价按照“3.4”项中的数据处理方法分析计算后，不同免疫分析方法测定的83/573和97/714效价详见表 2。WHO数据摘自《WHO人垂体泌乳素第4次国际标准品国际协作研究》报告。结果表明：本实验室上报83/573的免疫效价几何均值为64.7 mIU·安瓿-1，与WHO汇总数据67.2 mIU·安瓿-1之间相对偏差为-3.6%；上报的97/714的免疫效价几何均值为1 336.7 mIU·安瓿-1，与WHO汇总数据1 315.0 mIU·安瓿-1之间相对偏差仅为1.7%。
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表 2 以84/500计算83/573和97/714免疫活性测定值（mIU·安瓿-1） Table 2 Estimates of PRL immunoreactivity in mIU/amp for 83/573 and 97/714 calculated relative to 84/500(mIU per ampoule) |
直接通过不同免疫分析方法试剂盒标准曲线计算得到的83/573和97/714效价详见表 3。由于放免方法测定的各样本浓度值异常，WHO在统计时删去了该数据，不纳入分析。WHO数据摘自《WHO人垂体泌乳素第4次国际标准品国际协作研究》报告。结果表明：本实验室上报的84/500免疫效价几何均值为53.2 mIU·安瓿-1，与理论值（53.0 mIU·安瓿-1）的相对偏差仅为0.4%，与WHO汇总数据（55.3 mIU·安瓿-1）的相对偏差为-3.8%；上报的83/573的免疫效价几何均值为65.0 mIU·安瓿-1，与WHO汇总数据（68.1 mIU·安瓿-1）相对偏差为-4.6%；上报的97/714的免疫效价几何均值为1 342.0 mIU·安瓿-1，与WHO汇总数据（1 386.8 mIU·安瓿-1）相对偏差为-3.2%。
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表 3 以试剂盒校准品计算84/500、83/573和97/714免疫活性测定值（mIU·安瓿-1） Table 3 Estimates of PRL immunoreactivity in mIU/amp for 84/500, 83/573 and 97/714 calculated relative to the kit standards(mIU per ampoule) |
7个国家10个实验室共同完成了本次协作标定。除放免数据外，本实验室其他数据均被WHO采纳。经WHO统计组汇总分析，PRL候选品83/573免疫活性为67.2 mIU·安瓿-1，均匀性和稳定性均满足要求。经WHO生物标准专家委员会通过，将83/573作为PRL第4次国际标准品使用，免疫效价为67 mIU·安瓿-1。
6 讨论 6.1 PRL及历次国际标准品介绍PRL及历次国际标准品介绍人垂体源PRL是由人垂体前叶分泌的单链多肽激素，相对分子质量约为23 000 Da。其主要作用是促进乳房发育成熟、促进乳腺分泌乳汁，并且对性腺发育、免疫调节和促进骨代谢等都起着十分重要的作用。
在上世纪70年代末，就建立了泌乳素免疫分析第1次国际参考品（批号：75/504）[16]，用于泌乳素免疫分析校准用。之后又建立了第2次国际标准品（批号：83/562）和现行第3次国际标准品（批号：84/500）。我国现行PRL国家标准品（批号：150532-0004）就是溯源至84/500。第4次PRL国际标准品，由于无垂体源PRL原料捐赠，WHO启用了20世纪80年代制备的一批PRL样本（批号：83/573）作为候选品进行研究。83/573在1986年首次与2nd IS 83/562和3rd84/500一起进行评价。17个实验室采用放射免疫法分析测定这3个候选品，最终确定83/573浓度具有与83/562类似的泌乳素免疫反应性，效价为83/562的1.2倍，定值为63 mIU·安瓿-1。2001年建立人重组泌乳素国际参考品（批号：97/714）的协作标定中也对83/573进行了评价。11家实验室提供多种不同免疫方法进行了分析，5家实验室进行细胞增殖测定，以84/500为标准，免疫分析方法测定值为58.7 mIU·安瓿-1，生物学测定值为77.1 mIU·安瓿-1。本次协作标定的目的是，使用现在的免疫分析方法对83/573进行免疫反应性评估，以确定其是否适合作为国际标准品，并且通过分析16份人血清评价引入这支新标准品带来的潜在影响。
6.2 本次协作标定情况分析本次PRL国际协作研究中，本实验室选用免疫试剂最多（9家），涉及的测定方法也最全面（4种），其中以化学发光试剂为主（6家，含国产和进口试剂），被采纳数据最多（几乎达本次国际协作标定中全部采纳数据的50%），为NIBSC评价87/573作为第4次国际标准品提供了丰富、可靠的数据。这同时也表明了我国PRL定量测定分析水平得到充分认可。
以84/500为标准，各试剂检测系统上，83/573标准曲线与84/500标准曲线t检验均平行，表明2种标准品同质，采用83/573替换84/500对PRL免疫分析校准不会有较大影响。本实验室上报83/573的免疫效价几何均值（64.7 mIU·安瓿-1）与WHO汇总数据（67.2 mIU·安瓿-1）的相对偏差较小（仅为-3.6%），且各试剂测定值差异较小（GCV仅为4.8%）。各试剂测定84/500均值（53.2 mIU·安瓿-1）与理论值（53 mIU·安瓿-1）相对偏差仅为0.4%，变异系数仅为4.6%。这些数据反映了我国PRL定量测定试剂大部分产品与国际标准品比对良好，量值传递稳定，为各临床医院或实验室之间PRL测定值具有互换性奠定了一定的基础。
不过值得注意的是，本实验室提供的放免试剂数据，因测定值异常未被NIBSC采纳，这可能与放射免疫法试剂中采用的抗体为多克隆抗体，测定特异性不高，且放射免疫法为竞争性抑制反应，线性范围相对较窄，低浓度样本测定准确度降低有关。
6.3 PRL缓冲液的选择本实验室在参加PRL国际标准品协作标定以及标准品研制等工作中，发现采用不同分析缓冲液复溶84/500的差别非常大。结果显示，含一定浓度蛋白的稀释液复溶84/500冻干品后，测定值与理论值相当，而不含蛋白的去离子水或者PBS溶液复溶后，测定值显著低于理论值，约为理论值的40%~50%，最低仅为20%左右。因此在PRL赋值或者试剂研发过程中，采用不含蛋白的去离子水或者缓冲液，将产生明显偏移，最终导致完全错误的结果。究其原因，目前只查到有资料表明含一定蛋白的缓冲液可防止表面吸附作用，其他暂未检索到。因此在未确定原因之前，建议PRL试剂厂家在使用84/500时，采用含蛋白溶液复溶。
6.4 未来泌乳素标准化的问题由于垂体源的人PRL价格昂贵，且较难获得，所以重组来源的原料也是将来研制国际标准品候选品的备选方案之一。早在2001年WHO就建立了人重组泌乳素第1次国际参考品，但并没有将其作为国际标准品，仍然采用垂体源国际标准品校准PRL免疫分析系统，这是因为如果同时提供2种国际标准品的话，会增加混乱以及增大分析变异的可能性。2001年协作标定研究中，通过细胞扩增生物分析得到97/714效价为1 400 mU·安瓿-1（GCV为20%，n=5）。同时采用不同的免疫学方法评价该参考品，以84/500为标准品标定，其效价为1 265.9 mU·安瓿-1（GCV为27%，n=16）。本次研究中也同样对97/714进行了分析。采用免疫学方法，以84/500为标准品标定，其效价为1 315 mU·安瓿-1（GCV为20.7%，n=18），本实验室上报数据的变异系数也达到了23.7%（GCV为23.7%，n=8），远高于垂体源标准品83/573。表明重组来源PRL免疫反应性在不同体系还是有差异。在部分免疫分析方法中，重组标准品不具有互换性。尽管这样，以试剂盒标准或以97/714为标准，各实验室测定的血清样本均值具有很好的一致性，这就支持了重组参考品作为未来国际标准品的潜在可能性。并且WHO支持制造商进一步讨论和评估，以促进建立对病人样品测定影响最小的重组泌乳素国际标准品。
【致谢：本协作研究工作得到了北京北方生物技术研究所、北京倍爱康生物技术有限公司、广州市达瑞抗体工程技术有限公司、四川迈克生物科技股份有限公司、郑州安图生物工程股份有限公司、贝克曼库尔特商贸（中国）有限公司、索灵诊断医疗设备（上海）有限公司、西门子医学诊断产品（上海）有限公司、罗氏诊断产品（上海）有限公司、雅培贸易（上海）有限公司和深圳迈瑞生物医疗电子股份有限公司的大力协助。】
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