2017, Vol. 37 
2. 石河子大学生命科学学院, 石河子 832003
2. College of Life and Science, Shihezi University, Shihezi 832003, China
甘草为重要的常用中药，素有“国老”之称，具有止咳化痰、解毒清热、缓急止痛等作用。甘草的化学成分据报道有黄酮类化合物、三萜类化合物以及香豆素类、氨基酸、雌性激素、有机酸等多种成分[1-2]。其中甘草酸（亦称甘草甜素）为其主要成分，含量达3.63%~13.06%，可用于评价药材质量、药物制剂的稳定性[3-4]。
目前，对甘草酸的检测方法有高效液相色谱法、高效毛细管电泳法、薄层层析扫描法、气相色谱法等[5-6]。高效液相色谱法是目前中药分离检测常用的方法，具有柱效高，灵敏度高，分离速度快，适用范围广，重复性好和操作方便等优点，在中草药化学研究中得到了广泛的应用；但也存在样品前处理周期长，操作复杂，耗时费力，需要昂贵设备等问题[7-8]。目前人工栽培甘草的品质控制及研究前提就是甘草酸的含量，面对分析测定大量样品时所带来的困难，建立一种操作简便，灵敏度高，高通量，仪器化程度和分析成本低的检测新技术显得尤为重要[9]。
胶体金免疫层析试纸条具有检测快速，简单，抗基质干扰能力强等优点，因此是一种适合基层现场筛查的快速检测方法[10-12]，该技术通过目测检测线显色条带的有无或颜色的深浅进行结果判断，可以实现高灵敏度定性和半定量分析。本研究采用碳化二胺法制备甘草酸-牛血清白蛋白（BSA）免疫原和甘草酸-OVA包被原，用免疫原免疫Balb/c小鼠，利用杂交瘤技术制备并筛选出能够特异性稳定分泌抗甘草酸的单克隆抗体杂交瘤细胞株[13-14]。将甘草酸单克隆抗体标记胶体金，优化免疫原包被条件和上样垫处理液，建立了甘草酸免疫层析检测技术，以期为我国人工栽培甘草的品质控制及研究提供快捷、廉价的检测手段。
1 材料与方法 1.1 材料与试剂甘草酸，纯度99%，购置北京百灵威科技有限公司；氯金酸、牛血清白蛋白（BSA）、柠檬酸三钠、羊抗鼠IgG、卵清蛋白（OVA）、PVP-40、N-羟基琥珀酰亚胺（NHS）、N，N’-二环己基碳二亚胺（DCC）购自Sigma公司；硝酸纤维素膜（简称NC膜）购自Sartorius公司（CN140）；玻璃纤维膜（SB08、Ahlstrom8964）、PVC底板（DB-6）、吸水垫（H5076）购自上海捷一生物技术有限公司；抗甘草酸（GA）单克隆抗体、包被偶联GA-OVA为本实验室自制；胆酸、去氧胆酸、柴胡皂苷、黄芩苷、柚皮苷购于南京购自南京泽朗植提，纯度≥95%。其他试剂均为国产分析纯。
1.2 仪器与设备北京六一仪器厂DYY-7CD高压电泳仪；上海金标生物科技有限公司HM3010单维平面划膜喷金仪；HITACHI公司UV3010型紫外分光光度仪；BECKMAN公司LE-80型台式高速低温离心机；Bio-Rad公司Smartspec TM3000核酸蛋白分析仪；上海金标生物科技有限公司ZQ2000微电脑自动斩切机；BLO-RAD公司凝胶成像扫描仪；日本电子株式会社JEM-1230透射电子显微镜；MALVERN公司nano-ZS动态光散射仪；Thermo Scientific公司NanoDrop 2000超微量分光光度计。
1.3 方法 1.3.1 单克隆抗体的制备小鼠免疫：以BSA偶联甘草酸，与弗氏完全佐剂乳化成0.2 mL分别免疫8周龄Balb/c小鼠15只，采用腹腔与背部轮换注射方法，基础免疫10 d后，不完全弗氏佐剂乳化免疫抗原，每隔3周进行加强免疫。从第2次免疫开始，每次免疫后第8天，从小鼠眼眶采血，测效价，待效价达到要求后，分离出抗血清，即得抗体。用ELISA法检测血清抗体效价，若效价 > 10-4即可用于细胞融合，抗体的纯度用SDS-PAGE鉴定，具体实验方法参考徐志凯[15]。
采用有限稀释法筛选出阳性克隆获得杂交瘤细胞[15]；将建株后的细胞扩大培养，待细胞达到一定数量后收集杂交瘤细胞，清洗计数将细胞稀释至5×105个·mL-1；将8周龄Balb/c小鼠腹腔注入灭菌液体石蜡0.5 mL·只-1，7~10 d后注入上述杂交瘤细胞0.5 mL·只-1，7~10 d后抽取腹水，用间接ELISA（将包被抗原用包被液稀释后加入96孔酶标板中，每孔100 μL，4 ℃包被20 h；弃包被液，用洗涤液洗涤3次，每孔加封闭液200 μL。封闭1 h，弃封闭液，洗涤3次，将甘草酸单抗用PBS稀释成相应比例，分别取50 μL与50 μL 200 ng·mL-1的甘草酸标准液预混5~10 min后加入；竞争30 min，弃去竞争物和单抗混合物，洗涤3次，每孔加入50 μL HRP-羊抗兔IgG（H+L），37 ℃温育30 min；弃液后洗板3次，加入TMB显色底物，每孔50 μL，避光显色10 min；最后加入终止液，每孔50 μL。于450 nm波长下测定吸收度）获得测定腹水效价。用饱和硫酸铵盐法纯化McAb，将获得的McAb用2.5 μL的微量移液器点1 μL在NanoDrop2000超微量分光光度计的检测基座上，于280 nm的测定波长下测定蛋白含量。
1.3.2 胶体金的制备准确称取1 g氯金酸溶于100 mL双蒸水中，配成1%氯金酸盐溶液，称取100 mL超纯水加入洁净的150 mL三角瓶中，将1 mL 1%氯金酸溶液加入100 mL双蒸水中，并放入洁净搅拌子；然后将其放在已预热0.5 h的磁力搅拌器上，控制转速为250 r·min-1，缓慢加热至沸腾后立即快速加入2%柠檬酸三钠溶液7.5 mL，观察溶液的颜色变化，由黑色→紫色→深蓝→酒红色，当溶液的颜色完全变为透明的酒红色时，继续加热5 min后停止，冷却至室温，4 ℃贮存。
1.3.3 胶体金的电镜观察和紫外扫描将制备好的胶体金移液器吸取35 μL滴加在碳膜覆盖的铜网上，充分干燥后，在透射电子显微镜下观测其形貌，分散性，粒径大小。将制备好的胶体金5 mL加入到光程为1 cm的比色皿中，用紫外-可见分光光度计扫描波长范围在400~800 nm的吸收光谱。将制备好的胶体金加入到1 cm的测量皿中，在动态光散射仪上测定粒径分布动态光散射仪测定，测量胶体金溶液的均一度及金颗粒粒径、分散性、形貌等指标参数。
1.3.4 胶体金标记抗体取洁净西林瓶用烧制好的胶体金充分润洗后加入胶体金5 mL，按每毫升胶体金加入0.2 mol·L-1碳酸钾溶液4 μL，此时胶体金的pH为8.2，用移液器快速吹吸混匀，再按每毫升胶体金加入抗GA单克隆抗体10 μg，继续用移液器快速吹吸混匀，4 ℃静置过夜。再按每毫升胶体金加入10% BSA溶液100 μL，移液器吹吸混匀，室温下静置1 h；然后4 ℃ 8 000 r·min-1离心30 min，小心吸去上清，沉淀用含有1%BSA和10%蔗糖的PB缓冲液按每毫升胶体金100 μL进行重悬复溶。
1.3.5 胶体金免疫标记快速检测试纸条的组装用HM 3010平台系统在玻璃纤维膜上喷不同含量的金标抗体，室温干燥2 h。偶联抗原GA-OVA用0.01 mol·L-1 PBS（pH 7.4）稀释至0.5 mg·mL-1，用HM 3010平台系统喷于硝酸纤维素膜（NC膜）上，室温干燥2 h，此为检测线；在离检测线3 mm处喷上羊抗鼠IgG（1 mg·mL-1），此为质控线。将NC膜、金标垫、样品垫和吸水纸依次组装在底板上，然后用切刀切割成4 mm宽的试纸条装入检测卡中备用。
1.3.6 检测方法试纸条检测卡平放，将提取的甘草酸样品80 μL加到检测卡的加样孔中，6~8 min内观察结果。如果检测线上出现红色条带，说明样品呈阴性；如果检测线上没出现红色条带，说明样品呈阳性。如果质控线无条带，说明试纸条无效。
1.3.7 试纸条的特异性精密称取胆酸、去氧胆酸、柴胡皂苷、黄芩苷、柚皮苷的对照品适量，分别加甲醇制成1 μg·mL-1的溶液，以0.45 μm微孔滤膜滤过，即得各对照品储备溶液。取各对照品储备溶液，用甲醇稀释成质量浓度均分别为25、50、100 ng·mL-1的对照品溶液。用快速检测卡检测，每个浓度重复3次，判断试纸条的特异性。
1.3.8 试纸条的批内和批间重复试验取1 μg·mL-1甘草酸对照品储备溶液适量，以甲醇稀释制成25、50、100、200 ng·mL-1的甘草酸对照品溶液，分别用同批和不同批次的试纸条分别检测，每个浓度重复3次，观察其重复性。
1.3.9 试纸条的稳定性试验将试纸条密封后分别存放于37、25和4 ℃，观察不同温度对试纸条的影响。保存于37 ℃的试纸条每天取出4条分别检测25、50、100、200 ng·mL-1的甘草酸对照品溶液。保存于25℃的试纸条每3天取出4条分别检测25、50、100、200 ng·mL-1的甘草酸对照品溶液。保存于4 ℃的试纸条每周取出4条分别检测25、50、100、200 ng·mL-1的甘草酸对照品溶液。
1.3.10 样品检测选取甘肃、宁夏、陕西、新疆、吉林共5个地方的甘草根测定其甘草酸含量。精确称取甘草根粉样品0.1 000 g，置于50 mL量瓶中，用去离子水定容，常温下放置30 min，摇匀分装，3 500 r·min-1离心10 min，取上清液按浓度梯度稀释成1:100、1:1 000、1:10 000、1:100 000共4个倍数，即得供试品溶液，用于甘草酸竞争法试纸条含量测定，并与2015年版的中国药典中的HPLC检测法[采用Agilent 1100型高效液相色谱仪，Hypersil ODS C18色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）]进行对比。
2 结果与分析 2.1 抗体的效价和纯度分析结果抗体经紫外扫描，测得抗体质量浓度为10.03mg·mL-1，经间接ELISA测得腹水和抗体效价分别为1:4×106和1:2×106，表明抗体的活性基本未受影响。经SDS-PAGE电泳，抗体仅出现2条带，1条为IgG重链，约50 kD；另1条为轻链，约25 kD，而腹水则出现许多条带，表明抗体纯化取得了较好的效果。
2.2 胶体金表征分析制备的胶体金透射电镜表征见图 1-A，胶体金粒子呈现球形，分散性较好，颗粒大小均一。动态光散射仪表征结果见图 1-C，胶体金粒子粒径分布狭窄，分散性较好，粒径分布主要在40 nm左右。制备的胶体金在自然光照下呈酒红色，清澈透亮，室温下放置6个月仍能保持稳定，不发生沉淀析出。紫外-可见光分光光度计表征见图 1-B，其最高吸收峰在524 nm左右，峰形狭窄，与Choo J报道[14]40 nm胶体金的等离子共振吸收峰一致。
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A.胶体金颗粒直径（diameter of colloidal gold particles）B.紫外-可见光谱图（UV-Vis spectrum of the colloidal gold）C.动态光散射图（dynamic light scattering） 图 1 胶体金表征分析图 Figure 1 Colloidal gold characterization analysis diagram |
0 ng·mL-1甘草酸（阴性）样本检测时，检测线出现很深的红色条带，随着甘草酸对照品溶液的浓度增加，检测线条带逐渐减弱；当甘草酸对照品溶液质量浓度增至15 ng·mL-1时，检测线红色条带仍然可以出现，但是已经明显减弱；当甘草酸对照品溶液质量浓度继续增加至25 ng·mL-1时，检测线无红色条带出现；质控线均出现深红色条带（如图 2所示）。由此判断，该试纸条的灵敏度为50 ng·mL-1。
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1.5 ng·mL-1 2.10 ng·mL-1 3.15 ng·mL-1 4.25 ng·mL-1 5.50ng·mL-1 图 2 试纸条对不同浓度甘草酸含量检测结果图 Figure 2 Detection results of different concentrations of glycyrrhizic acid on the strip |
由表 1可知，甘草酸快速检测试纸条与其他类似物没有交叉反应，只针对甘草酸有特异性结合。
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表 1 甘草酸快速检测试纸条的特异性 Table 1 Specificity of glycyrrhizic acid rapid test strip |
用同一批试纸条检测5、10、15、25、50 ng·mL-1的甘草酸对照品溶液，试验重复3次，结果显示，甘草酸快速检测试纸条的批内和批间重复性为100%，假阳性率和假阴性率均为0。
2.6 稳定性检测分别用保存20、40、80 d的胶体金试纸条对5、10、15、25、50 ng·mL-1的甘草酸对照品溶液进行检测，检测结果均未发现改变。
2.7 样品检测结果新疆本地、甘肃、宁夏、内蒙、陕西5个地区的野生甘草根按“1.3.10”项方法制备供试品溶液后，用中国药典的HPLC方法测定，然后用甘草酸快速检测试纸条进行测定。检测结果如表 2所示，5个地区样本中的甘草酸在试纸条均表现为阳性，表明甘草酸含量均超过25 ng·mL-1，说明甘草酸快速检测试纸条是快速、准确和可靠的检测方法，目前可满足生产实践大规模对甘草中甘草酸的快速筛选要求。
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表 2 不同地区甘草根中甘草酸快速检测试纸条测定与HPLC法的验证 Table 2 Contents of GA samples from 5 provinces determined by the strip and the HPLC method |
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图 3 试纸条对不同地区样品中甘草酸含量检测结果图 Figure 3 Detection results of samples from 5 provinces on the strip |
甘草酸相对分子质量较小，免疫原性较弱，属于半抗原，必须和相应的载体蛋白交联，才能作为免疫原刺激机体产生免疫应答反应[9]。本研究前期选择BSA作为载体蛋白，应用碳化二胺法将甘草酸与BSA偶联制成全抗原甘草酸-BSA，并通过紫外分光光度计扫描法证明甘草酸已与BSA交联成功。
建立甘草酸快速检测试纸的核心之一就是特异性强，灵敏度高，亲和力强的单克隆抗体，前期研究选择了皮下注射与腹腔注射相结合，并制定了小剂量、长周期、多次数的免疫方案，使甘草酸抗原产生了很强的免疫原性，并且尽量避免了小鼠因注射部位皮肤脓肿而感染导致死亡。小鼠免疫间隔时间分别为10 d、10 d、10 d，融合前进行采血测量效价，以确保小鼠脾脏内正处于增殖状态的B淋巴细胞数量达到最多的状态。结果表明，选择的实验动物个体、数量及其免疫方案是可行的，免疫效果理想，得到了特异性好、灵敏度高的单克隆抗体，为建立甘草酸快速检测试纸条奠定了良好的基础。
胶体金免疫层析技术是20世纪80年代在胶体金标记技术和新材料技术基础上建立的一种独特的免疫学检测技术。它以检测速度快，简单、直观、便宜、适用备受关注。并且已经广泛应用于疾病诊断、法医鉴定、药物残留检测、海关检查和环境监测等领域，尤其是在药物残留分析方面发挥着巨大作用[16]。
基于竞争法的免疫层析技术检测原理，在结合垫上有胶体金标记的甘草酸单克隆抗体；在硝酸纤维素膜的检测线上（T线）包被有甘草酸-OVA偶联物作为包被原；在硝酸纤维素膜的质控线上（C线）包被有抗金标的二抗[17-18]。上样垫经过特殊处理后，在上样垫上滴加甘草根提取物，样品流经上样垫至结合垫上与金标抗体结合，随后流至硝酸纤维素膜上，并在硝酸纤维素膜上层析展开。优化金标垫上胶体金标记抗体的喷涂量和NC膜上甘草酸-OVA的包被量，在上样垫上滴加甘草根提取物，当样本中甘草酸含量超过25 ng·mL-1，会使胶体金标记的甘草酸单抗达到饱和状态，当该复合物随样本流经检测线时，不会与NC膜上甘草酸-OVA反应，则不会显示条带；当样本中甘草酸含量没有超过25 ng·mL-1，胶体金标记甘草酸单抗未饱和，会与NC膜上的甘草酸-OVA反应显示红色条带，其他未被捕捉的金标抗体继续层析展开，当到达质控线时金标抗体抗原复合物与质控线上的二抗结合，形成可目视的条带。试纸条以硝酸纤维素膜上显示红色线条为判别标准，当试纸条出现1条红色条带说明样本含有甘草酸且含量超过25 ng·mL-1；当试纸条出现2条红色条带说明样本中不含有或含量没有达到25 ng·mL-1。
本研究所建立的甘草酸快速免疫层析检测技术具有以下优点：①样品前处理方法简单、安全，只需水浸，不需要有毒有害化学试剂；②适用于大样本测定，可以大大提高工作效率，减轻工作强度；③测定费用低廉；④可以快速鉴定甘草酸的真伪，对于基层单位和有大样品需要分析的场合具有明显的优势。另外，本实验对甘草酸快速检测试纸的反应条件进行了探索，建立了灵敏、特异，操作简单，适于大批量甘草酸分离筛选的检测方法，为从甘草样本中迅速高效地分离、提取和纯化甘草酸奠定了基础，为甘草高产优质栽培及生物化学调控技术的应用研究和品种选育提供了新的生物技术手段。
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