胺碘酮（amiodarone，AM）为第Ⅲ类抗心律失常药，临床上广泛用于阵发性室性心动过速、室颤及其他药物无效的阵发性室上性心动过速、心房扑动、心房颤动的预防和治疗^[1-3]。但AM的治疗指数低，安全范围窄，个体差异大，为了保证用药的有效性和安全性，需要对其进行治疗药物浓度监测^[4]。去乙基胺碘酮（desethylamiodarone，DEA）是AM的主要代谢产物，具有与AM类似的生理活性和电生理效应^[5]，因此，同时对DEA进行监测是必要的。

沈雄荣^[6]、刘学红^[7]和张婷^[8]等分别报道了RP-HPLC（C₁₈柱）同时测定AM和DEA血药浓度的方法，但血样前处理中均需先用有机溶剂进行液-液萃取，除去有机溶剂并复溶后方可进样，操作烦琐，耗时耗力；黄一玲^[9]等报道用氰基柱（CN柱）同时测定AM和DEA血药浓度的方法，但氰基柱不如C₁₈柱普遍，其前处理方法中也需要进行氮气吹干和复溶；本课题组在1993年报道过用薄层扫描法同时监测AM和DEA血药浓度的方法^[10]，但前处理同样需要进行液-液萃取，而且分离度和灵敏度容易受到薄层板的厚度及患者进餐的影响。本文运用HPLC技术和C₁₈柱，以结构相近的同类药品决奈达隆（dronedarone，DN）为内标，新建了一种快速测定AM和DEA血药浓度的方法，30 min即可出结果，大大方便了临床。

1 仪器与试药

安捷伦公司Agilent 1260 Infinity液相色谱分离系统（包括四元梯度泵、自动进样器和柱温箱）、Agilent 1260二极管阵列检测器、OpenLAB工作站；Alltech公司Alltima C₁₈色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm；填料：十八烷基硅烷键合硅胶）；梅特勒公司Mettler XP-205十万分之一电子天平；Scientific Industries VORTEX-Genie^®-2涡流振荡器；Abbott公司高速离心机；Millipore公司MilliQ 2150型超纯水器。日本岛津公司CS-930薄层扫描仪，青岛海洋化工厂分厂硅胶GF254薄层板（厚度0.l mm，用前120 ℃活化l h）。乙腈、甲醇为色谱纯，磷酸氢二钠、磷酸二氢钠、磷酸、无水乙醇、异丙醇、氨水均为分析纯。

AM（盐酸盐）对照品（纯度99.7%，批号201006）购自中国食品药品检定研究院，DEA（盐酸盐）对照品（纯度98%，批号1-YMK-27-1）购自加拿大Toronto Research Chemicals，DN（盐酸盐）对照品（纯度99.6%，批号110501）购自上海芷威化学科技有限公司。血样203份，由患者遵医嘱于早晨空腹未服药时采集，用血清管抽取静脉血4~5 mL，2~4 ℃冰箱冷藏保存。患者年龄33~102岁，男139例，女64例。送检日期：2014年10月~2015年12月。

2 方法 2.1 色谱条件

色谱柱：Alltima C₁₈（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流动相：乙腈-100 mmol·L^-1磷酸二氢钠（磷酸调pH至3.0）（55:45）；流速：1.0 mL·min^-1；柱温：30 ℃；检测波长：241 nm；进样量：100 μL。

2.2 储备液的制备

精密称取DN对照品20.041 4 mg于100 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置10 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得内标储备液（质量浓度为20.04 μg·mL^-1）。精密称取AM对照品9.605 0 mg及DEA对照品10.210 1 mg于100 mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，精密量取1 mL置10mL量瓶中，用乙腈溶解并稀释至刻度，摇匀，即得混合对照品储备液（质量浓度分别为AM 9.605 μg·mL^-1，DEA 10.21μg·mL^-1）。

2.3 对照液和质控液的制备

精密量取空白血清0.5 mL于2 mL离心管中，精密加入混合对照品储备液和内标储备液各0.1 mL，乙腈1.0 mL，涡旋1 min，13 000 r·min^-1离心5 min，上清液用0.20 μm滤膜滤过，即得对照液（质量浓度约为2 μg·mL^-1）。精密量取空白血清0.5mL于2mL离心管中，精密加入混合对照品储备液5、25、100 μL，内标储备液0.1 mL和乙腈适量（使总体积为1.7 mL），同法制备质量浓度约为0.1、0.5、2 μg·mL^-1的对照液作为质控液。

2.4 供试液的制备

精密量取待测血清0.5 mL于2 mL离心管中，精密加入内标储备液0.1 mL及乙腈1.1 mL，涡旋1 min，13 000 r·min^-1离心5 min，上清液用0.20 μm滤膜滤过，即得。

2.5 空白血清液的制备

精密量取空白血清0.5 mL于2 mL离心管中，加乙腈1.2 mL，涡旋1 min，13 000 r·min^-1离心5 min，上清液用0.20 μm滤膜滤过，即得。

3 结果与讨论 3.1 专属性

选取6份不同个体的血清样本，分别制备空白血清液、对照液和供试液，进样分析，得到的典型色谱图见图 1。单次进样在12 min之内结束，DN、DEA、AM色谱峰之间均有良好的分离度。空白血清中的内源性物质均在5 min之内出峰，不干扰测定。进一步考察了硝酸甘油、地高辛、阿托伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀、华法林、硝苯地平、奎尼丁等临床常和AM合用的药物对测定的干扰，硝酸甘油在该色谱条件下不出峰，地高辛、硝苯地平和奎尼丁均在4 min之前出峰，阿托伐他汀、匹伐他汀、辛伐他汀均在12 min后出峰，华法林在7.3 min出峰，均不干扰测定。说明本方法具有较好的专属性。

3.2 线性和灵敏度

按照“2.3”项下方法分别制备AM和DEA的血药浓度约为0.05、0.1、0.25、0.5、1.0、2.0、4.0 μg·mL^-1的对照液，每个浓度制备5份（n=5），进样分析后，以峰面积平均值与内标峰面积平均值的比值Y作为纵坐标，以质量浓度X作为横坐标绘制标准曲线。AM、DEA的线性回归方程分别为：

Y=1.282X-0.028 4  r=0.999 6

Y=1.335X-0.038 6  r=0.999 8

线性范围分别为0.048~3.842 μg·mL^-1和0.051~ 4.084 μg·mL^-1。以信噪比（S/N）约为3.0时的血药浓度为检测限（LOD），信噪比（S/N）约为10.0时的血药浓度为定量限（LOQ），测得AM和DEA的LOD均为0.02 μg·mL^-1，LOQ均为0.05 μg·mL^-1，灵敏度完全能满足最小起效浓度（0.5 μg·mL^-1 AM，0.2μg·mL^-1 DEA）的测定^[11]。

3.3 准确度和精密度

按照“2.3”项下质控液的制备方法，分别制备3个浓度的质控液，每个浓度制备6份，连续制备5 d（d1~d5），d1测得浓度和实际加入浓度的比值作为相对回收率，RSD作为日内精密度（n=6），d1~d5测得浓度的RSD作为日间精密度（n=5）。在d1同时用0.5 mL纯化水代替0.5 mL空白血清制备同浓度无血清质控液，以质控液峰面积平均值与无血清质控液峰面积平均值的比值作为绝对回收率。准确度和精密度的考察结果见表 1。

3.4 稳定性

精密量取空白血清0.5 mL于2 mL离心管中，精密加入混合对照品储备液5、25、100 μL，每个添加浓度制备12份，其中3份在室温放置24 h后，按照“2.3”项下质控液的制备方法制备溶液并测定；3份在-20 ℃冰箱中反复冻融3次后同法制备溶液并测定；3份在2~4 ℃冰箱中放置3个月后同法制备溶液并测定；3份即刻同法制备溶液后在自动进样器中放置24 h后测定。结果显示：2~4 ℃冰箱中放置3个月后血清颜色会出现变深现象，但各实验条件下测定浓度和理论浓度的相对误差（RE）均小于±9%，说明方法稳定性良好。

3.5 血样测定及方法学比较

运用新建方法对203份血样进行了测定，测得AM的血药浓度范围为0.05~3.48 μg· mL^-1之间，DEA的范围为0.05~1.70 μg·mL^-1之间。对其中的64份血样用新建的方法（HPLC法）和本室之前报道的薄层扫描法（TLC法）^[10]进行了方法学比较（见图 2），2种方法AM测定结果的相关系数（r）为0.979 1，DEA的相关系数（r）为0.968 9，说明两者之间具有良好的相关性；对2种方法的测定结果进行配对t检验，结果显示：AM的P=0.310 > 0.05，DEA的P=0.121 > 0.05，说明2种方法无显著性差异。但在 < 0.2 μg·mL^-1的低浓度区，AM的P=0.030 < 0.05（n=3），DEA的P=0.000 < 0.05（n=13），2种方法测定结果具显著性差异，HPLC法测定结果普遍高于TLC法，可能和HPLC法的灵敏度好于TLC法有关。

4 讨论 4.1 流动相的选择

AM、DEA和内标DN均为脂溶性碱性化合物，在中性和弱碱性流动性中峰形较好^[12]，但在中碱性条件下，3种成分均以游离碱分子态形式存在，在C₁₈色谱柱中保留时间很长，不利于快速测定。选用酸性的磷酸二氢钠（磷酸调pH至3.0）作为流动相，可使3种成分的游离碱以离子态存在，大大缩短了分析时间。在对磷酸二氢钠缓冲液浓度的进一步优化中发现，缓冲液浓度 < 50 mmol·L^-1时，3种成分均不出峰；缓冲液浓度≥100 mmol·L^-1时，3种成分均出峰，峰形和分离度均较好，考虑到过高的缓冲液浓度会影响液相色谱的泵系统和色谱柱寿命，所以选择100 mmol·L^-1的磷酸二氢钠作为缓冲液。

4.2 检测波长的选择

AM和DEA在流动相中的最大紫外吸收峰均在241 nm附近，DN的最大紫外吸收峰在290 nm附近，但在241 nm处也有较大吸收，最终确定检测波长为241 nm。

4.3 样品提取方法的选择

本研究曾尝试过液-液萃取和固相萃取（SPE）等血样的前处理方法，发现液-液萃取不但操作复杂，而且回收率和精密度受血样酸化缓冲液的pH影响很大，高血脂血样也会影响回收率。固相萃取发现AM的回收率和精密度较好，但DEA的精密度较差。本文采用乙腈蛋白沉淀后直接取上清液进样的方法，不但操作极为简单，而且回收率和精密度均很好。

4.4 血药浓度监测结果和参考范围的初步探讨

从血药浓度的监测结果分析：在负荷期，由于服药时间不长，体内主要以AM为主，其浓度和负荷量成正比；在维持期（7~14 d后），AM浓度基本平稳，DEA浓度逐步升高，AM与DEA的浓度比值逐步降低，长期服药者该比值维持在1.0~1.5之间，但个体差异较大，这和文献报道^[11]类似；在停药期，AM浓度逐步下降，DEA浓度则是前期较为稳定，后期逐步下降，此时AM与DEA的浓度比值往往 < 1.0。

国内文献报道AM的有效血药浓度为0.5~2.0 μg· mL^{-1[11, 13]}，DEA为0.2~1.0 μg·mL^-1[13]；国外文献报道为AM 0.5~2.5 μg·mL^-1，严重的毒性主要在血药浓度超过2.5 μg·mL^-1时出现^[14-17]，对于DEA的范围则未见报道。由于临床反映很大一部分在给药初期和停药期间虽AM浓度较低但确有一定疗效，本室执行的AM有效血药浓度参考范围为0.2~2.0 μg·mL^-1，DEA结果不设范围，只作为参考。