中药材硫熏有近百年历史^[1-2]，曾合法应用于山药等少数药材加工养护^[3]。由于硫熏可杀虫防霉，漂白美化药材，加之操作简单，成本低廉，近年来呈现过度熏蒸和品种蔓延之势。研究证实中药材过度硫熏导致SO₂、重金属等有害物严重超标^[4-8]。研究还发现硫熏会引起药材中化学组分的改变^[9-13]，进而影响其体内过程^[14-15]和药理活性^[16-17]，存在一定的安全隐患^[18-19]。中国药典自2005年版起全面取消了中药材的硫熏工艺，并自2010年版起采用SO₂限量检控硫熏药材^[20]。但我们在应用过程中发现，该方法存在一定局限性^[21-22]。因此，建立更加科学、可行的硫熏药材检控方法显得尤为迫切。本文分析了当前各种检控方法的优点和不足，探讨了创新研究方法和检控策略，为深入研究硫熏药材检控方法和修订完善检控标准提供新思路。

1 硫熏中药材检控方法回顾

2000年版及之前版中国药典收载了山药、葛根等几味药材的硫熏工艺^{[3, 23]}，但鉴于国内外各界对硫熏药材有效性和安全性的质疑，2005年版中国药典全面取消了中药材硫熏工艺^[24-25]，同时在附录中增加了SO₂残留测定法，并在2010年版中国药典第二增补本中制定了SO₂限量标准，规定白芍、山药等10味中药材及其饮片SO₂残留量不得超过400 mg·kg^-1，其他中药材及饮片不得超过150mg·kg^{-1[20, 26]}。至2015年版中国药典又增加规定山药片SO₂残留量不得超过10 mg·kg^-1[27]。但SO₂残留测定法的局限性在实际应用过程中也逐渐显现。随着对硫熏药材化学成分变化的进一步认识，硫熏特征标志物检控方法、特征图谱鉴别法等其他方法也相继被开发。

1.1 SO₂残留量测定法

SO₂残留限量检测是国内外较为通用的监管食品中亚硫酸盐添加剂的手段^[7]，当前国际国内均参考食品SO₂残留检测法检控硫熏药材^[7-8]。2010年版中国药典收录了蒸馏碘滴定法用于检测药材中的SO₂残留量^[20]，2015年版中国药典将该方法修订为酸碱滴定法，同时还收载了气相色谱法和离子色谱法^[28]。

1.1.1 滴定法

滴定法是目前检测SO₂残留量的主要方法，该方法基本原理是中药材残留的亚硫酸（盐）在酸性条件下加热蒸馏，产生的SO₂由氮气带出后测定。吴越等^[8]采用酸蒸馏碘滴定法检测市场抽查的80个品种的307批次中药材及饮片，SO₂残留量以150 mg·kg^-1为限度，超限率为38.6%。毕文艳等^[29]测定了19个品种的136批次中药饮片，超限率为69.1%。由于硫熏药材中残留的亚硫酸盐系列物质以多种形式存在于药材中，酸化后不能以恒定速率释放SO₂，2015年版中国药典将药材的蒸馏时间延长至1.5 h（2010年版中国药典为3 min），并将碘滴定法改进为酸碱滴定法^[28]，提高了方法的重复性。

1.1.2 色谱法

顶空气相色谱法和离子色谱法是2015年版中国药典新收载方法。气相色谱法采用了与滴定法相同的样品预处理反应原理，在密闭容器中，将亚硫酸盐系列物质盐酸酸化后生成SO₂气体，待测样品采用石蜡封层来解决稳定性问题，再通过顶空进样系统进入气相色谱仪，采用热导检测器检测。郏征伟等^[30]应用该法测定了97批次中药材或饮片的SO₂残留量，检出率为53%。

离子色谱法将硫熏药材中亚硫酸盐系列物质加酸处理后转化为SO₂，随水蒸气蒸馏，并被双氧水吸收、氧化为硫酸根离子后，再采用离子色谱检测。刘海静等^[31]运用该法测定当归中SO₂残留，显示该方法精密度、重复性良好，准确度较高；吴越等^[32]采用在线渗析结合离子色谱法，更大程度地去除大分子杂质，提高测量准确度。

1.1.3 光谱法

根据亚硫酸盐-邻苯二甲醛-铵盐在中性或弱酸性条件下反应生成具有强烈荧光的化合物1-磺酸基-异吲哚的反应原理，彭月等^[33]采用氢氧化钠碱提硫熏药材中可逆结合态的亚硫酸盐，建立了荧光衍生化法测定中药材中SO₂残留量，将该方法应用于硫熏山药、葛根、枸杞、人参和浙贝母等药材的检测^[33-35]，结果显示与滴定法相比，荧光衍生化法更快速，灵敏度和准确度更高。周琳等^[36]合成了一种增强型罗丹明衍生物荧光探针，利用其在水-醇介质中与HSO₃^-发生加成反应，导致罗丹明衍生物中的螺内酰胺开环可使探针荧光明显增强的原理，将此荧光探针用于检测市售硫熏药材中的SO₂残留量，快速、准确，具有一定的实用性。

1.2 元素测定法

郝延军等^[37]采用改良古蔡氏法对牡丹皮、山药和金银花中含硫化合物的残留量进行测定，利用活泼金属单质在稀盐酸中能还原亚硫酸或亚硫酸盐，进一步与醋酸铅反应生成硫化铅沉淀。将待测样品的硫化铅斑点与标准斑点比对，确定硫化物的含量范围，作为快速检验硫熏药材的定性和半定量方法。钟虹敏等^[38]首先对部分已知硫熏或未硫熏中药进行硫元素测定，以此确立硫熏药材的判定标准（含硫量大于0.5%判定为硫熏药材），并对10种药材进行硫熏与否判别。

1.3 特征图谱法

硫熏药材化学成分发生了质和量的改变，从而导致药材红外、紫外等吸收光谱和色谱特征的改变。因此，特征图谱可用于鉴别硫熏和非硫熏药材。刘静静等^[39-41]应用傅里叶变换红外光谱法快速鉴别硫熏白芍、当归和菊花；吴晓毅等^[42]根据近红外光谱数据信息，采用聚类分析法快速区分硫熏白芷和非硫熏白芷；刘晓等^[43-46]通过HPLC指纹图谱法鉴别硫熏菊花、升麻和当归；Cai等^[47-48]采用GC-MS法鉴别硫熏金银花和杭菊花；罗丽萍等^[49]建立了基于表面解析常压化学电离质谱指纹图谱结合化学计量学手段快速区分硫熏与未熏八角的方法。

1.4 硫熏特征标志物检控方法

硫熏过程中产生的SO₂具有强氧化性，会与药材中的部分成分发生化学反应，生成一系列新化合物^{[9-13, 50-53]}。这些新成分仅存在于硫熏药材中，是药材在硫熏后产生的特征性成分，具有专属性，是区分硫熏与未硫熏药材的特征标志物。研究显示利用这些特征标志物可建立硫熏药材专属性检控方法，并可应用于药材和中成药的检控。

1.4.1 以硫熏特征标志物为对照物质的色谱法

对于硫熏后产生含量较高的硫熏特征成分，可通过制备分离该化合物，建立以该化合物为对照的定性和定量检测方法。研究发现白芍硫熏过程中主要活性成分芍药苷转化成芍药苷亚硫酸酯，且随着硫熏时间的延长，芍药苷亚硫酸酯的含量呈线性升高^{[10, 54-55]}。通过分离制备芍药苷亚硫酸酯对照物质，建立以芍药苷亚硫酸酯为指标的HPLC定性筛查和定量方法，可以有效检测出硫熏白芍药材，并客观反映白芍的硫熏程度和药材品质变化程度^[54]。Wu等^[56]利用芍药苷和芍药苷亚硫酸酯质谱碎片特征，采用HPLC-TQ-MS/MS分析技术，建立了多反应离子扫描（MRM）检测方法筛查硫熏白芍，并将其应用于含硫熏白芍中成药的筛查，显示了方法的专属性。

1.4.2 以硫熏标志物特征离子结合硫熏对照药材比对的色谱-质谱法

对于部分硫熏后成分变化明显，但短时间内较难得到硫熏特征标志物对照品的药材，可建立以硫熏标志物特征离子结合对照药材比对的色谱-质谱筛查方法。Li等^[9]研究发现，人参硫熏后会产生至少35个人参皂苷的含硫衍生物，周珊珊等^[57]通过研究硫熏人参对照药材中这些含硫衍生物质谱裂解规律和色谱-质谱条件优化，选择质谱响应较高的含硫衍生物作为标志物，以其特征离子m/z 879.44作为筛查离子，建立了UPLC-QTOF-MS/MS结合自制硫熏人参对照药材的快速筛查商品硫熏人参的方法。

1.4.3 利用植物代谢组学策略快速发现硫熏特征标志物，建立以硫熏特征标志物为参照物的色谱-质谱法

部分药材经硫熏后通过常规的分析手段很难快速发现成分转化产生的特征成分。Bai等^[44]采用植物代谢组学的研究思路与方法，将硫熏前后当归色谱-质谱测定数据进行主成分分析（PCA）和正交偏最小二乘判别分析（OPLS-DA）等多变量统计处理，快速发现硫熏前后当归的差异成分，找到仅存在于硫熏当归的特征化合物，经质谱解析等手段鉴定出一系列当归活性成分藁本内酯的含硫衍生物。通过质谱条件的优化，建立了在ESI-模式下以m/z 271.06作为特征筛查离子的UPLC-QTOF-MS/MS筛查方法，并应用于商品当归药材和饮片的筛查^[13]。Li等^[53]对不同硫熏时间牡丹皮的UPLC-QTOF-MS/MS测定数据进行多变量统计分析，发现了一系列硫熏牡丹皮特征标志物，最终优选出含硫特征离子（m/z 259.02）作为筛查离子的硫熏牡丹皮专属性鉴别方法。

2 硫熏药材检控方法综合评价

现有硫熏药材的检控方法由于其测定原理和技术不同，各有其优点与不足。

滴定法检测SO₂残留量具有装置简单，成本低廉，适于推广应用的优点。但耗时较长，重复性和专属性欠佳。如该方法检测苦杏仁和炮山甲等药材时易出现假阳性^[30]；对于硫熏引起化学成分结构变化，产生含硫衍生物（硫熏特征成分）的药材，该检测方法则存在假阴性。例如刘欢欢等^[21]采用2010年版中国药典（第一增补本附录Ⅸ U）SO₂蒸馏滴定测定法，比较不同硫熏时间白芍SO₂残留量与硫熏后生成的芍药苷亚硫酸酯含量的关系，发现随着硫熏时间延长，药材中芍药苷转化成芍药苷亚硫酸酯的量增多，而测得的SO₂残留量未明显增加，SO₂残留量不与芍药苷亚硫酸酯的量成正相关，且测得值的RSD大于20%，提示该方法不能真正反映白芍的硫熏程度，且重复性较差。进一步将酸蒸馏时间延长至120 min，芍药苷亚硫酸酯释放SO₂的转化率也仅为50%，表明即使采用中国药典2015年版改进后的方法，仍会存在假阴性。李秀扬等^[22]考察了硫熏牡丹皮中SO₂的稳定性，硫熏样品贮藏8个月后，SO₂逸失，残留量明显下降，表明SO₂残留量具有不稳定性。Duan等^[58]研究发现硫熏当归药材中SO₂残留量与硫熏程度不呈正相关，SO₂残留量低不一定代表样品硫熏时间短。上述研究均显示SO₂残留量滴定法存在一定的局限性。

气相色谱法和离子色谱法是将药材中的亚硫酸盐系列物质加酸处理转化为SO₂后测定，测定方法具有灵敏、自动化程度高的特点，可以排除其他化合物的干扰。但这2种方法样品前处理原理与滴定法相同，可能同样存在假阴性或假阳性的不足。

元素测定法直接测定药材中的总硫含量，方法简便快速，但对本身含硫的药材并不适用，且土壤、环境等因素干扰较大，判断标准的建立还需大量样品验证。

特征图谱法关注硫熏后药材内在成分的变化，具有专属性强的优点，且省去了样品复杂的处理过程，操作简便。但结果的判定一般需与化学计量学手段相结合，由于中药材本身质量差异较大，其结果正确率有待提高。

硫熏特征标志物检控法针对药材硫熏后发生成分转化产生新的硫熏特征成分的药材，专属性强；一般采用多维色谱的方法，前处理简单，精密度、准确度、灵敏度高，稳定性好；应用范围广，可应用于药材、中成药的定性筛查和定量评价。硫熏特征标志物检控法着眼于药材内在质量的变化，但无法检控硫熏导致的药材外源SO₂残留，也不适用于对硫熏后可能不产生特征成分的药材。特征图谱法和硫熏特征标志物检控法均对检测仪器有较高的要求。

各种方法优点和不足比较见表 1。

3 硫熏药材专属性检控方法和指标选择创新研究策略探讨

中药材及饮片的硫熏养护工艺始于20世纪初期，在古代本草中并没有记载，硫熏药材更缺乏中医理论基础和临床实践的依据，因此该方法的应用一直存在争议^{[1-2, 59]}。基于硫熏药材特别是硫熏导致化学成分转化的药材，其临床功效和安全性数据缺乏的现状，检控硫熏药材很有必要。中国药典2015年版应用SO₂残留量作为指标检控药材外源性有害物质残留，对保证药材的安全性具有重要意义。但其限量制订仅依据了SO₂本身的安全剂量，不能客观反映硫熏药材成分转化后内在质量及潜在的药效和毒性改变；另外，检测不完全和药材存放SO₂逸失导致的假阴性^[21]，药材本身因素的假阳性^[30]，均使得SO₂残留指标不一定能真实反映药材硫熏程度及内在品质变化程度，从而不能有效地保证药材的安全性和有效性。硫熏特征标志物检控方法能真实体现药材的硫熏程度和内在质量变化程度，是药材内在质量控制的有效手段。其供试品溶液制备简便，测定直接高效，具有准确度、灵敏度高及专属性强的特点，同时该法可适用于药材（饮片）和中成药等的筛查，是当前硫熏成分变化药材SO₂限量检控方法的有效补充，具有良好的应用前景。随着研究的深入，硫熏特征标志物检控方法的建立仍有若干关键性问题亟需解决。1）硫熏特征标志物的快速发现、分离、制备和鉴定。传统的天然药物化学研究方法和手段工作强度大，用时长，不能满足对硫熏中药材新产生成分的快速发现和解析的要求，应用植物代谢组学快速发现和鉴别硫熏标志物，可望成为建立硫熏标志物检控方法的有效策略^{[13, 53, 60]}；2）以硫熏特征标志物的限量来检控硫熏药材，其含量必须与药材硫熏程度存在一定相关性，若两者无关联，该指标仅作为定性鉴别指标。因此，必须加强硫熏特征标志物含量与硫熏程度的关联性研究^[54]；3）阐明硫熏程度与药材硫熏特征成分含量、毒性和药效之间的量变关联性，是创建真正反映药材内在品质、毒性和药效的硫熏药材质量控制方法和标准的基础。因此，硫熏特征标志物关联的药理或毒理也应该是重点研究课题^[16]；4）选择稳定的质量检控指标是建立质控方法的关键，通过考察各种因素对硫熏特征标志物的影响，检验其作为质量标志物的稳定性，是最终确定硫熏特征标志物作为中药硫熏检控指标可行性的保证。

建立能真正体现药材安全、有效和可控的硫熏药材质量评价体系，必须将内在质量控制与外源有害物控制相结合，因此，在对硫熏药材成分、药效、毒性等深入研究的基础上，制定合理的SO₂残留量和硫熏特征标志物（质或量）相结合的硫熏药材检控方法和限量标准，才是完善的硫熏药材检控体系^[22]。同时，积极寻找安全、有效和可行的药材硫熏养护替代技术^[61]，可从根本上保证临床用药安全有效。