2017, Vol. 37 
表1(Table 1)
近来，化妆品中非法添加禁用药物越来越引起国家监督机构和广大消费者的重视。我国《化妆品卫生规范》（2007）规定了化妆品使用原料中禁用物质1 208项、限用物质73项、限用防腐剂56项、限用防晒剂28项、限用着色剂156项，化妆品组分中暂时允许使用的染发剂93项，共计1614项，但是卫生化学标准检验方法只有27个，涉及76项指标，总的方法覆盖率仅为4.7%[1]。对非法添加禁用药物的检测并非化妆品质量检测的常规检测项目，其难点在于非法添加的禁用药物具有不确定性，不同的生产企业可能添加不同的药物，因此需要进行全面的筛查。根据文献调研[2]和市场调查的结果，抗生素类和某些糖皮质激素类药物因对痤疮有一定的治疗效果而被添加到祛痘类化妆品中。含抗生素的化妆品除了会引发皮疹外，严重时可能引起血液病，长期使用含激素的化妆品，易形成激素依赖性，出现皮肤色素沉着、痤疮样皮炎等反应，给消费者带来危害。目前报道的方法多为针对几种抗生素或者激素类药物的分别检测，且方法不具有可扩展性[3-6]。针对以上问题，本研究应用液质联用技术建立了能够快速筛查祛痘类化妆品中17种非法添加成分的高通量检测方法[7-13]，并建立这17种药物的液质联用图谱数据库，且所建立的方法具有可扩展性，可以根据需要不断添加所要检测的药物，扩大所建立的液质联用数据库[14-15]。
1 仪器与试药AB Sciex 3200 Qtrap质谱仪（美国AB Sciex公司），Shiseido Nanospace高效液相色谱仪（日本Shiseido公司），Analyst工作站（美国AB Sciex公司）。Sigma1-14离心机（Thermo Electron公司），TP-600超声波清洗机（天鹏电子新技术有限公司）。
甲酸为色谱纯（Merck公司），浓氨水为色谱纯（Merck公司），水为蒸馏水，乙腈为色谱纯（Merck公司）。对照品盐酸米诺环素、盐酸土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素、甲硝唑、林可霉素、克林霉素磷酸酯、泼尼松龙、强的松、氢化可的松、可的松、甲泼尼龙、曲安西龙、曲安奈德和地塞米松由中国食品药品检定研究院提供。化妆品包括各种祛痘洁面乳、抗痘面膜、祛痘益肤霜、消痘霜、消痘精华液等。
2 方法 2.1 测定条件 2.1.1 质谱条件质谱测定采用电喷雾（ESI）离子源并在正离子模式下进行。电喷雾电压为4 kV，离子源温度：550 ℃，气帘气、气体1和气体2的压力分别为172.4、275.8和275.8 kPa。在多反应监测（MRM）扫描模式下监测17个待测药物的离子强度最强的离子通道，每个药物的最佳参数列于表 1。在增强子离子（EPI）扫描模式下，扫描速度为4 000Da·s-1，碰撞能量为35 eV，碰撞能量扩展（CES）为15 eV。信息关联采集（IDA）设定为当MRM的响应值大于1 000 CPS时，触发EPI扫描。
|
表 1 17个药物的MRM最优化参数值和保留时间 Table 1 MRM parameters and retention time for each drug |
色谱柱：ACE C18（十八烷基硅烷键合硅胶）色谱柱（75 mm×2.1 mm，3 μm），保护柱（10 mm×2.1 mm，3 μm），流动相：5 mmol·L-1甲酸铵溶液（pH为3.5）-乙腈进行梯度洗脱，梯度为0 min到0.1 min（10%乙腈）→3.0 min（90%乙腈），维持1 min后回到起始梯度，分析时间为9 min；流速：0.3 mL·min-1，柱温：30 ℃；进样量：10 μL。
2.2 对照品溶液的制备分别准确称取盐酸米诺环素、土霉素、盐酸四环素、盐酸金霉素、盐酸多西环素、氯霉素、甲硝唑、林可霉素、克林霉素磷酸酯，泼尼松龙、强的松、氢化可的松、可的松、甲泼尼龙、曲安西龙、曲安奈德和地塞米松的对照品，用甲醇溶解并稀释成1.0 mg·mL-1的对照品储备液。用稀释液（5 mmol·L-1甲酸铵溶液-乙腈（10：1））将对照品储备液分别稀释成10、1和100 ng·mL-1的对照品溶液。
2.3 供试品溶液的制备取供试品0.5 g，置10 mL具塞比色管中，如为膏状需均匀涂布，加甲醇-0.1 mol·L-1盐酸（1：1）的混合溶液至10 mL，振摇，超声30 min，使其分散。经0.45 μm滤膜过滤，滤液用稀释液稀释10倍后进样测试。
2.4 实验方法整个实验方法如图 1所示，首先应用MRM液质联用技术建立1次实验能同时检测17种药物的高通量、高灵敏度的筛查系统。通过建立能够进行谱图检索的液质联用质谱数据库，对药物进行定性。通过信息关联采集模式将2个数据库连接起来，实现整体化解决方案，即在1次检测中能同时完成17种药物的筛查和定性分析。
|
图 1 分析方法流程图 Figure 1 Schematic representation of analytical process |
多重反应监测（multiple reaction monitoring，MRM）技术作为质谱检测的分析方法，是一种基于已知或假定的反应离子信息，有针对性地选择数据进行质谱信号采集，对符合规则的离子进行信号记录，去除不符合规则离子信号的干扰，通过对数据的统计分析从而获取质谱定量信息的质谱技术，具有特异性强、灵敏度高、准确度高、重现性好、线性动态范围宽的突出优点，因此，实验中将MRM扫描作为调查性扫描，以获得高灵敏度的响应信号，排除基质干扰。对于MRM技术而言，关键在于首先要能够检测到具有特异性的母离子，然后只将选定的特异性母离子进行碰撞诱导（collision-induced），最后选择特异子离子进行质谱信号的采集。其中需要对每个目标药物的所选定的离子通道的测定条件进行优化，得到最佳的响应值。实验中对每个待测药物进行手动优化，以确定最佳的DP、CE和CXP参数值。图 2以林可霉素为例来说明确定最佳参数值的方法。A：以针泵进样，在Q1模式下采集到待测化合物的[M+H]+峰，并确定其稳定存在。林可霉素的[M+H]+峰为m/z 407。B：单独选择m/z 407的色谱峰，确定其最佳的DP值，图中可以看出其最佳的DP值为得到曲线的最高点，即45 V。C：在MS2模式下，确定林可霉素的子离子，在不同的碰撞电压下，分子离子峰被逐步打碎，产生不同的离子碎片，图中显示林可霉素的子离子主要为359、126。D：在MRM模式下，根据以上选择的2个离子通道407/359，407/126，测定其最佳的CE值，图中可以看出2条曲线，强度高的曲线为407/126这个离子通道，也是我们选择的离子强度最强的离子通道，其最佳的CE值为37 eV。E：确定407/126这个离子通道的最佳CXP值为3V。这样一个流程下来，就完成了对一个化合物的优化。表 1列出了17个待测药物的保留时间和MRM最佳参数值。图 3为17种药物的MRM色谱图，17种药物的离子通道不同，所以不需要在色谱上完全分开，只要质谱上或者色谱上能够分开就可以准确定性和定量。图 4为分别提取的17种药物色谱图，显示不存在对这17种药物有干扰的物质，可独立定量。需要说明的是17种药物中的氯霉素在正离子模式下的灵敏度要低于负离子模式，但是为建立统一的筛查方法，仍然采用正离子模式进行扫描。
|
A.选择[M+H]+（selection of protonated molecule）B.优化DP参数（optimization of DP）C.优化CE参数（optimization of CE）D.选择3对典型离子通道（Identification of the three most abundant product ions）E.优化CXP参数（optimization of CXP） 图 2 林可霉素MRM最佳参数值优化过程示意图 Figure 2 Schematic representation of MRM parameters optimization process for lincomycin |
|
图 3 17种药物的MRM色谱图 Figure 3 MRM chromatogram of mixture for the 17 analytes |
|
图 4 17种药物的提取色谱图 Figure 4 Extracted MRM chromatograms of the 17 analytes |
3 200 Q-Trap系统是将串联四极杆和离子阱结合在一起的质谱系统，其Q3可以进行离子阱扫描，能够实现串联四极杆扫描和离子阱扫描的快速转换，从而同时获得初筛和定性的数据。对于LC-MS/MS系统来说，同一个药物，在不同类型、不同厂家的仪器、不同的碰撞的碰撞能量条件下得到的质谱谱图都是不同的，因此在不同条件下采集的质谱图不能用于质谱库检索，因此没有像GC-MS那样不同实验室通用的质谱检索数据库。本研究的目的是建立实验室使用的LC-MS/MS检索数据库，在统一的条件下采集药物的EPI质谱图，将每个药物的典型质谱图保存到工作站的质谱库中，完成对药物质谱检索数据库的建立。实验中应用碰撞能量扩展功能（CES），在1次子离子扫描中完成在3个不同的碰撞能量下EPI谱图的采集，最终给出3个谱图的总和，这样经过1次扫描就能够同时得到药物从高质量数到低质量数的典型质谱图（图 5）。实验中采集了这17种药物的典型质谱图，建立了质谱检索数据库。
|
A.碰撞能量20 eV（CE of 20 eV）B.碰撞能量20 eV（CE of 35 eV）C.碰撞能量50 eV（CE of 50 eV）D.碰撞能量35 eV，碰撞能量扩展15 eV，得到20，35和50 eV 3个碰撞能量下质谱图的总和，得到更多的碎片信息（CE of 35 eV with CES of 15 eV，which is the sum of the spectra at three different CEs（20，35，50 eV），provided more information in a single spectrum 图 5 林可霉素在不同碰撞能量下的质谱图比较 Figure 5 Comparison of EPI spectra of Lincomycin under different CEs |
通过建立信息关联采集（IDA）逻辑扫描方式将MRM筛查EPI定性联系起来，这样在1次分析中就可以既得到高灵敏度的MRM响应谱图，又可以得到对药物进行定性分析的EPI谱图。当所检测药物的MRM响应强度大于所设定的阈值时，IDA就会自动触发EPI扫描，从而得到该化合物的质谱图，用于质谱库检索，得到化合物定性结果。这样在一次分析中就可以同时得到初筛和定性结果。
Scheduled MRM质谱检测技术是近年来发展起来的新技术，应用这种扫描方式可以在1次实验中同时测定1 000种以上的化合物，实现高通量药物分析。文献报道，利用Scheduled MRM技术和药物质谱数据库检索技术，已经实现了一次测定同时对血浆中302种药物的初筛和定性，整个测定过程只需要7 min[14]。本次试验仅根据实验需要采集了17种药物的质谱图，这仅占质谱检索数据库的一小部分，在今后的工作中，根据检测对象的不同，可以不断地采集药物的质谱图添加到质谱检索数据库中，通过Scheduled的方式不断扩充和完善质谱检索数据库。
4 方法的应用利用建立的液质联用数据库技术对抽检的祛痘类化妆品进行检测，在9 min内能同时得到对以上17种非法添加药物的筛查和定性结果，大大提高了工作效率。如图 6所示，某一厂家的产品在筛查中有2个可疑色谱峰，MRM筛查结果显示样品中含有甲硝唑和林可霉素，同时利用所得到的这2个色谱峰的EPI谱图，经质谱库检索，确证这2个化合物分别为甲硝唑和林可霉素（图 7）。
|
A.实际样品的总离子流图，初筛结果显示样品中含有17种非法添加药物中的2个（TIC of the unknown sample in which 17 transitions were monitored and two of them are positive）B.保留时间为2.03 min的MRM色谱峰，筛查结果显示为甲硝唑（extracted chromatogram of the unknown peak with retention time 2.03 min，and screening result is metronidazole）C.保留时间2.03 min色谱峰的EPI质谱图（EPI spectrum of the unknown peak）D.保留时间2.83 min的MRM色谱峰，筛查结果显示为林可霉素（extracted chromatogram of the unknown peak with retention time 2.83min，and screening result is lincomycin）E.保留时间为2.83 min色谱峰的EPI质谱图（EPI spectrum of the unknown peak） 图 6 实际样品测定的阳性结果 Figure 6 Example of the identification of Metronidazole and Lincomycin in real world sample |
|
A.图 6-C的质谱库检索结果，显示此化合物为甲硝唑[library searching result indicated that the target compound（Fig. 6-C）is Metronidazole] B.图 6-E的质谱库检索结果，显示此化合物为林可霉素[library searching result indicated that the target compound（Fig. 6-E）is Lincomycin] 图 7 液质联用检索数据库的检测结果 Figure 7 Identification of target compound by library searching |
在对100多批祛痘类化妆品的抽检中，应用《化妆品卫生规范》（2007年版）中常规的液相检测方法（化妆品中5种四环素类抗生素及甲硝唑、氯霉素的标准检测方法）检测，发现49批可疑样品；由于化妆品中其他成分的干扰，仅通过HPLC结果无法准确确定样品中是否含有非法添加药品。应用我们所建立的方法对这49批样品进行了检测，其中5批样品同时检测到甲硝唑和林可霉素，6批样品检测到林可霉素，2批样品检测到地塞米松，避免了假阳性结果的出现。此外，对应用抗生素微生物检定法筛查到的9批具有明显抑菌活性的产品，应用本方法进一步检测，发现这9批样品都含有林可霉素。
5 结论本实验应用液质联用检索数据库技术所建立的快速测定祛痘类化妆品中17种非法添加药物的方法，在祛痘类化妆品的检验中大大提高了工作效率。本方法简便快速，准确可靠，在9 min内即可同时完成对样品的筛查和定性分析，避免了假阳性结果的出现。这一技术的成功应用，为非法添加物的测定提供了新的思路。所建立的数据库不仅能对化妆品、保健食品中的非法添加药物进行定性确认，且在各类药物突发事件的应急检验中也将发挥作用，使我国在药物液质联用质谱库的研究中与世界领先水平接轨。
| [1] |
化妆品卫生规范[S]. 2007 Hygienic standard for cosmetics[S]. 2007 |
| [2] |
吴大南, 郑和辉, 杨丽华, 等. 祛痘除螨类化妆品中检出抗生素情况的调查[J]. 中国卫生检验杂志, 2006, 16(2): 216. WU DN, ZHENG HH, YANG LH, et al. Investigation report of detection of antibiotics in anti-acne cosmetics[J]. Chin J Health Lab Tec, 2006, 16(2): 216. |
| [3] |
窦佳, 栾爽, 沈丹丹, 等. 高效液相色谱-二极管阵列检测法测定化妆品中6种抗生素[J]. 中国卫生检验杂志, 2014, 24(19): 2759. DOU J, LUAN S, SHEN DD, et al. Determination of six antibiotics in cosmetics by high performance liquid chromatography with diode array detector detection[J]. Chin J Health Lab Tec, 2014, 24(19): 2759. |
| [4] |
刘华良, 杨润, 李放, 等. 化妆品中7种常见抗生素的超高效液相色谱测定法[J]. 环境与健康杂志, 2009, 26(5): 453. LIU HL, YANG R, LI F, et al. Determination of seven antibiotics in cosmetics by ultra performance liquid chromatography[J]. J Environ Health, 2009, 26(5): 453. |
| [5] |
刘华良, 李放, 杨润, 等. 超高效液相色谱-串联质谱法分析化妆品中的常见抗生素及甲硝唑[J]. 色谱, 2009, 27(1): 50. LIU HL, LI F, YANG R, et al. Determination of common antibiotics and metronidazole in cosmetics by ultra performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry[J]. Chin J Chromatogr, 2009, 27(1): 50. |
| [6] |
杨艳伟, 朱英, 张卫强, 等. 化妆品中7种抗生素及地塞米松磷酸钠和水杨酸的高效液相色谱测定法[J]. 环境与健康杂志, 2006, 23(3): 264. YANG YW, ZHU Y, ZHANG WQ, et al. Determination of 7 kinds of antibiotics, Dexamethasone phosphate disodium salt and salicylic acid in anti-acne cosmetics by high performance liquid chromatography[J]. J Environ Health, 2006, 23(3): 264. |
| [7] |
GUAN FY, UBOH CE, SOMA LR, et al. High-throughput UHPLCMS/MS method for the detection, quantification and identification of fifty-five anabolic and androgenic steroids in equine plasma[J]. J Mass Spect, 2010, 45: 1270. DOI:10.1002/jms.v45:11 |
| [8] |
LI XQ, UBOH CE, SOMA LR, et al. Simultaneous separation and confirmation of amphetamine and related drugs in equine plasma by non-aqueous capillary-electrophoresis-tandem mass spectrometry[J]. Drug Test Anal, 2010, 2: 70. |
| [9] |
YOU YW, UBOH CE, SOMA LR, et al. Ultra-performance liquid chromatography/tandem mass spectrometry in high-throughput detection, quantification and confirmation of anabolic steroids in equine plasma[J]. Rapid Commun Mass Spect, 2009, 23: 2035. DOI:10.1002/rcm.v23:13 |
| [10] |
LI XQ, UBOH CE, SOMA LR, et al. Sensitive hydrophilic interation liquid chromatography/tandem mass spectrometry method for rapid detection, quantification and confimation of cathinone-derived designer drugs for doping control in equine plasma[J]. Rapid Commun Mass Spect, 2014, 28: 217. DOI:10.1002/rcm.6778 |
| [11] |
YOU YW, UBOH CE, SOMA LR, et al. Simultaneous separation and determination of 16 testosterone and nandrolone esters in equine plasma using ultra high performance liquid chromatography-tandem mass sepctrometry for doping control[J]. J Chromatogr A, 2011, 1218: 3982. DOI:10.1016/j.chroma.2011.04.087 |
| [12] |
LIU Y, UBOH CE, LI XQ, et al. Validated LC-MS-MS method for simultaneous analysis of 17 barbiturates in horse plasma for doping control[J]. J Anal Toxicol, 2017. DOI:10.1093/jat/bkx025 |
| [13] |
YOU YW, UBOH CE, SOMA LR, et al. Validated UHPLC-MSMS method for rapid analysis of capsaicin and dihydrocapsaicin in equine plasma for doping control[J]. J Anal Toxicol, 2013, 37: 122. DOI:10.1093/jat/bks098 |
| [14] |
LIU Y, UBOH CE, SOMA LR, et al. Efficient use of retention time for the analysis of 302 drugs in equine plasma by liquid chromatography-MS/MS with scheduled multiple reaction monitoring and instant library searching for doping control[J]. Anal Chem, 2011, 83: 6834. DOI:10.1021/ac2016163 |
| [15] |
LIU Y, UBOH CE, SOMA LR, et al. Detection and confirmation of 60 anabolic and androgenic steroids in equine plasma by liquid chromatography-tandem mass spectrometry with library searching[J]. Drug Test Anal, 2011, 3: 54. DOI:10.1002/dta.168 |