2017, Vol. 37 
2. 广东省天然药物标准物质分离企业重点实验室, 广州 510663;
3. 广东省中药香雪工程技术研究中心, 广州 510663;
4. 暨南大学中西医结合博士后流动站, 广州 510632
2. Key Laboratory of Standard Material in Natural Medicine of Guangdong Province, Guangzhou 510663, China;
3. Xiangxue Engineering Research Center for Chinese Medicine of Guangdong Province, Guangzhou 510663, China;
4. Integrated Chinese and Western Medicine Postdoctoral Research Station, Jinan University, Guangzhou 510632, China
大孔树脂具有优良的物化稳定性和化学吸附性，已成为中药提取分离过程中常用的高分子材料，但必须对残留溶剂进行控制，才能为其安全应用提供保证。根据国家食品药品监督管理总局对药物研究的有关技术要求，需对工艺中涉及使用到的大孔树脂进行树脂残留物的检测，控制其在规定的限量以内[1]，因此，必须建立灵敏、准确、快速的测定方法。国家新药审评中心相关文件亦指出苯乙烯骨架型大孔树脂应建立相关树脂残留物检测方法，并应将树脂残留物含量控制在标准限度以内[2]。大孔树脂常见的残留物包括正己烷、甲基环己烷、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯、苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯等[3-8]。本研究对人参总皂苷中树脂残留物进行检测，并测定上述10个可能的树脂残留物，为提取物和其他相关产品的质量标准提高提供参考。
1 仪器及试药 1.1 仪器XP205型电子天平（十万分之一，瑞士METTLER TOLEDO）；MS204S型电子天平（万分之一，瑞士METTLER TOLEDO）；7890A气相色谱仪（FID检测器，安捷伦）；TRI PLUS 300 HS顶空进样器（Thermo）；自制超纯水（Millipore）；HP-INNOWax色谱柱（极性聚乙二醇键合固定相，30 m×0.32 mm，0.25 μm，安捷伦科技有限公司）
1.2 试药N，N-二甲基甲酰胺（≥99.9%，DMF，ALADDIN）；苯（≥99.9%，ALADDIN）；甲苯（≥99.9%，ALADDIN）；邻二甲苯（≥99%，ALADDIN）；间二甲苯（≥99.5%，ALADDIN）；对二甲苯（≥99.8%，ALADDIN）；正己烷（≥99.5%，ALADDIN）；苯乙烯（≥99.5%，ALADDIN）；甲基环己烷（≥99.8%，ALADDIN）；二乙烯苯（ALADDIN）；1，2-二乙基苯（≥99.0%，ALORICH）；人参总皂苷（市售3批，西安常恒医药有限公司）。
2 方法与结果 2.1 色谱条件采用HP-INNOWax色谱柱（极性聚乙二醇键合固定相，30 m×0.32 mm，0.25 μm），柱温为程序升温，起始温度60 ℃，保持1 min，以0.3 ℃·min-1升至62 ℃，再以10 ℃·min-1升至140 ℃，保持5 min；FID检测器，载气为氮气，流速为1 mL·min-1，进样口温度为220 ℃，检测器温度为250 ℃。分流比为10：1；顶空进样，顶空平衡温度90 ℃，平衡时间为30 min，定量环温度为110 ℃，传输管温度为130 ℃，低速振摇。
2.2 对照品溶液的制备取苯约20 mg，精密称定，置10 mL量瓶中，加DMF稀释至刻度，摇匀，做为溶液①，取正己烷、甲基环己烷、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯各约20 mg，精密称定，置100 mL量瓶中，精密加入溶液①1 mL，加DMF稀释至刻度，摇匀，作为对照品储备液。精密量取对照品储备液5 mL，置100 mL量瓶中，加10% DMF稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置10 mL顶空进样瓶中，加盖密封，即得。
2.3 供试品溶液的制备取人参总皂苷提取物0.5 g，精密称定，置10 mL顶空进样瓶中，精密加入10% DMF溶液5 mL，加盖密封，超声使之充分混匀，即得。
2.4 测定方法分别精密量取对照品溶液和供试品溶液的顶空气体1 mL，注入气相色谱仪，测定，即得。
2.5 分析方法考察 2.5.1 溶剂浓度的考察按“对照品溶液的制备”方法，精密量取所制备的对照品储备液5 mL，3份，置100 mL量瓶中，分别加10%、25%、40%的DMF稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，置顶空进样瓶中，加盖密封，按照上述色谱条件和测定方法，进样测定，结果见表 1。从表 1结果发现，随着DMF溶剂浓度的增加，大部分成分的峰面积相应减小，表明溶剂浓度的提高并不能增加残留物成分的溶解度，故最终选用10% DMF作为溶剂。
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表 1 不同溶剂色谱峰面积考察（pA·s） Table 1 Effect of solvent concentrations on peak areas of residues |
精密量取对照品储备液5 mL，置100 mL量瓶中，加入10% DMF稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，3份，置顶空进样瓶中，加盖密封，分别于85、90、95 ℃于顶空进样器中加热平衡10 min，进行测定，结果见表 2。从表 2结果可以看出，各色谱峰峰面积在平衡温度为90 ℃时达到最大，温度偏高或偏低均不利于成分的测定，故最终选用90 ℃为顶空平衡温度。
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表 2 不同顶空平衡温度对峰面积的影响考察(pA·s) Table 2 Effect of equilibrium temperatureon peak areas of residues |
精密量取对照品储备液5 mL，置100 mL量瓶中，加入10% DMF稀释至刻度，摇匀，精密量取5 mL，3份，置顶空进样瓶中，加盖密封，分别于90 ℃加热平衡10、20、30 min，进行测定，结果见表 3。由表 3结果看出，随着平衡时间的延长，各残留成分峰面积均有一定程度的增加，根据测定结果，最终选用30 min作为顶空平衡时间。
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表 3 顶空平衡时间对峰面积影响考察(pA·s) Table 3 Effect of equilibrium time on peak areas of residues |
按照上述色谱条件，理论塔板数按苯峰计算大于50 000，苯、正己烷、甲基环己烷、甲苯、邻二甲苯、对二甲苯、间二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯的分离度（R＞1.5）均符合要求。各分析物保留时间如下：正己烷2.788 min、甲基环己烷3.112 min、苯4.200 min；甲苯5.640 min；对二甲苯8.043 min；间二甲苯8.253 min；邻二甲苯9.564 min；苯乙烯11.480 min；1，2-二乙基苯12.977 min；DMF 13.243 min；二乙烯苯14.924、15.090、17.055、17.375 min（见图 1）。
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1.正己烷（n-hexane）2.甲基环己烷（hexahydrotoluene）3.苯（benzene）4.甲苯（methylbenzene）5.对二甲苯（p-xylene）6.间二甲苯（m-xylene）7.邻二甲苯（o-xylene）8.苯乙烯（styrene）9. 1，2-二乙基苯（1，2-diethylbenzene）10. DMF11.二乙烯苯（divinylbenzene） 图 1 空白对照（A）、对照品（B）和供试品（C）色谱图 Figure 1 GC chromatograms of blank(A), reference substances(B)and sample(C) |
按“对照品溶液的制备”、“供试品溶液的制备”方法制备空白溶剂、混合对照品溶液以及对供试品溶液，按上述顶空气相色谱条件分析测定，结果见图 1。由结果可以看出空白阴性无干扰，对照品和供试品色谱峰达到良好分离。
2.6.3 标准曲线精密量取对照品储备液适量，分别稀释至5个不同浓度的对照品溶液，依法测定。以色谱峰峰面积（pA·s）为纵坐标，对照品浓度（µg·mL-1）为横坐标绘制标准曲线，结果见表 4。
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表 4 各残留物成分线性关系 Table 4 Linearity of ten residues |
按“对照品溶液的制备”方法制备对照品溶液5份，测定，计算各色谱峰峰面积RSD，结果见表 5。由表 5可以看出，各色谱峰的RSD均＜5%，表明本色谱系统的精密度良好。
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表 5 精密度试验 Table 5 Precision test |
按逐步稀释对照品溶液方法，以各分析物峰信噪比为S/N=3时，对应对照品浓度为检测限，信噪比S/N=10时，对应的对照液浓度为定量限，逐步稀释并进行测定，结果见表 6。
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表 6 检测限与定量限考察(μg·mL-1) Table 6 LOD and LOQ |
按“对照品溶液的制备”方法制备对照品储备液。精密量取对照品储备液1 mL，置100 mL量瓶中，加10% DMF稀释至刻度，摇匀，作为溶液②。
按“供试品溶液的制备”方法制备供试液6份，分别置于顶空进样瓶中，精密加入溶液② 5 mL，超声使之充分混匀，按照顶空气相条件测定，测定结果见表 7。表 7结果表明，双龙方保心片的加样回收率在94%~105%之间，RSD均小于5%，表明该测定方法的回收率良好。
| $ 回收率 = \frac{{测得量 - \left( {样品取样 \times 已知样品百分含量} \right)}}{加入对照品量} \times 100\% $ |
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表 7 回收率考察结果 Table 7 Results of recovery |
取3批人参总皂苷提取物，按“供试品溶液的制备”方法制备供试品溶液，按照顶空气相条件，吸取顶空气体1 mL，进样测定，结果见表 8。
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表 8 样品树脂残留物测定 Table 8 Determination results |
上述结果表明，3批市售的人参总皂苷提取物中检出的树脂残留物成分仅为邻二甲苯，且含量限度在1.5 µg·g-1左右，小于国家标准规定限度[9]，其他残留成分如正己烷、甲基环己烷、苯、甲苯、对二甲苯、间二甲苯、苯乙烯、1，2-二乙基苯和二乙烯苯色谱峰相应位置均未被检出明显色谱峰。
3 讨论不同的溶剂种类对供试品和待测残留物成分的溶解度也不一样，因此需要选择适宜的溶剂且不能干扰待测残留物的测定。本研究考察了10%、25%和40%的DMF对残留物成分的溶解性，结果10%的DMF溶解性较佳。
由于样品所含树脂残留物成分较低[10-12]，且顶空进样采用顶空气进样，对照品浓度较低，故精密度试验RSD出现部分大于3%，但符合中国药典2015年版不大于10%的要求[9]，同时线性方程相关系数均在0.99以上。
由于二乙烯苯在色谱中表现为4个峰[13-15]，在精密度试验、线性方程、检测限和定量限以及回收率试验中均以4个峰的加和进行计算。
随着中药新药注册技术要求的不断提高且逐渐达到药品注册的国际技术要求（ICH），有针对性地建立中药产品以及中药新药中涉及树脂纯化工艺的树脂残留物检测测定方法，具有较高的参考意义，为药品的安全性提供质量保证。
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